Диагностика протозойных инфекций. Микроскопическое исследование испражнений

Методы прижизненной лабораторной диагностики гельминтозов:

— гельминтокопрологические исследования;

— гельминтоовоскопические исследования;

— гельминтоларвоскопические исследования;

— иммунобиологическая диагностика;

— диагностическая дегельминтизация и другие методы;

Методы посмертной диагностики:

— патологоанатомические исследования;

— полные и неполные гельминтологические вскрытия органов и тканей (ПГВ и НПГВ).

Прежде чем перейти перечисленных выше вопросов данной темы, считаю уместным дать определение понятия «инвазия» и «инвазионные болезни».

Инвазионные болезни могут протекать как в клинически выраженной форме со значительной смертностью, так и в скрытой (латентной) форме.

В диагностике инвазионных болезней решающее значение имеют лабораторные исследования, в результате которых устанавливается возбудитель.

Рассмотрим методы прижизненной диагностики гельминтозов. Для этого используют как макро- , так и микроскопические исследования, прежде всего фекалий, мочи, крови, дермы, содержимого полостей организма и др. Эти методы гельминто-диагностических исследований, направленные на отыскание и изучение самих гельминтов, их фрагментов Илии яиц и личинок наиболее доказательны и широко применяются для диагностики гельминтозов.

Материал для диагностических исследований должен быть свободен от всяких посторонних примесей и загрязнений, фекалии рекомендуется брать из прямой кишки животного, они должны быть свежими, их следует держать на холоде (не >5 о С), можно также консервировать 5-10 % раствором формалина или карболовой кислоты.

Гельминтоскопия – применяется для обнаружения в фекалиях целых экземпляров гельминтов или их фрагментов, особенно при исследовании на цестодозы кишечника. Этот метод используется также для контроля эффективности проведённой дегельминтизации, для учёта количества изгнанных гельминтов. Для этих исследований необходимо брать всю единовременную порцию фекалий, а с целью учёта эффективности дегельминтизации следует собирать все экскременты, выделенные животным в течение 2-4 суток после обработки. Собранные фекалии предварительно осматривают невооружённым глазом. Затем их помещают в металлический сосуд, разбавляют 5-10 кратным количеством воды, перемешивают и дают некоторое время отстояться, затем верхний слой сливают (до осадка) и снова добавляют воду. Эти манипуляции последовательного промывания и отстаивания проделывают несколько раз. Полученный осадок небольшими порциями исследуют в кюветках (чашках Петри) на белом и чёрном фоне. Всех видимых гельминтов выбирают иглой и исследуют под микроскопом, устанавливая вид.

Гельминтоовоскопия – это методы диагностики гельминтозов в результате обнаружения в материале яиц гельминтов. Для проведения таких исследований применяют следующее оборудование и средства: микроскоп биологический, предметные стёкла, чашки Петри, стакана стеклянные или пластмассовые (диаметром не > 4-5 см), мензурки объёмом 50 мл, фильтрационные ситечки (с капроновой сеткой, чулочной), стеклянные палочки, металлические петли с диаметром кольца 8-10 мм.

Для диагностических исследований используют флотационные растворы. Наилучшей флотационной способностью обладают растворы при температуре 20-22 о С. Плотность раствора уточняем денсиметром. Насыщенный раствор технической селитры или аммония нитрата с плотностью 1,32 (1500 г на 1 литр кипящей воды); натриевой селитры или натрия нитрата с плотностью 1,38 (соотношение соли и горячей воды 1:1); магния сульфата (сернокислая магнезия)с плотностью 1,26-1,28 (920 г на 1 литр горячей воды); натрия тиосульфата или гипосульфита натрия, плотностью 1,38-1,40 (1750 г на 1 литр кипящей воды); сульфат цинка плотностью 1,24 (400 г на 1 литр воды); поваренная соль, плотностью 1,2 (400 г соли в 1 литре воды нагревают до кипения), применяют в холодном состоянии.

Самый простой метод гельминтоовоскопического исследования фекалий – это метод нативного мазка. Небольшой кусочек фекалий помещают на предметное стекло, добавляют 2-3 капли смеси равных частей глицерина и воды, тщательно смешивают, покрывают покровным стеклом и смотрят под микроскопом. Этот метод ненадёжный, так как при слабой инвазии даёт отрицательный результат.

Метод последовательного промывания (метод осаждения, седиментации) применяют для диагностики трематодозов животных, яйца возбудителей которых имеют большой удельный вес и не улавливаются методом всплывания (флотации). Берут 5 г фекалий, смешивают с10 кратным количеством воды, фильтруют через сито или марлю и фильтрат отстаивают 5 минут. Далее жидкость сливают, а к осадку добавляют чистую воду и снова отстаивают 5 минут. До тех пор пока жидкость не станет прозрачной. Жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом на наличие трематод.

Для диагностики нематодозов и цестодозов чаще всего используют флотационные методы. Наиболее распространённый и чаще применяемый – метод Фюллеборна. Для этого берут 10-20 г фекалий, помещают его в банку или стакан ёмкостью 100-200 мл, тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли. Общее количество добавляемого раствора должно быть примерно в 20 раз больше количества фекалий. Затем фильтруем и оставляем на 30 минут. С поверхности отстоявшейся жидкости металлической петлёй снимаем плёнку и переносим её на предметное стекло, покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом. Метод Щербовича используют для обнаружения яиц с более высокой плотностью (например, яйца метастронгилид), для чего используют насыщенный раствор сернокислой магнезии. Пробу фекалий (3-5 г) размешивают в воде до получения равномерной взвеси. Фильтруем через ситечко в центрифужную пробирку и центрифугируем 1-2 минуты. Верхний слой сливают, а к осадку добавляют насыщенный раствор сернокислой магнезии, хорошо размешиваем и снова центрифугируем 1-2 минуты. Затем металлической петлёй снимают верхнюю плёнку, помещают её на предметное стекло, накрывают покровным и исследуем под микроскопом.

Метод Котельникова и Хренова. Пробу фекалий (3 г) кладут в стакан и заливают небольшим количеством насыщенного раствора аммиачной селитры, размешиваем стеклянной (деревянной) палочкой и добавляем раствор до 50 мл. Взвесь фильтруем в другой стакан и оставляем на 10-15 минут. Снимаем петлёй 3-4 капли с поверхности, переносим их на предметное стекло и микроскопируем под малым увеличением микроскопа. Обнаруживаем яйца аскарид, трихоцефал, эзофагостом, стронгилоидесов, метастронгилид, неоаскарид, стронгилят органов пищеварения, мониезий и тизаниезий, параскарид, токсокарисов и др.

Метод Н.В. Демидова для диагностики фасциолёза. Пробу фекалий (3г от овец, 5 г от крупного рогатого скота), помещают в стакан, наливают насыщенный раствор хлористого натрия, тщательно размешиваем стеклянной палочкой, отстаивают 15-20 минут. С поверхности удаляют крупные частицы; жидкость отсасывают спринцовкой, или осторожно сливают, оставляют примерно 20-30 мл, к осадку добавляют воду до полного объёма стакана, тщательно размешивают, фильтруют через сито или 1 слой марли; жидкость снова отсасываем, оставляя 15-20 мл осадка; осадок переливают в маленькие конические стаканы, отстаиваем 3-5 минут, жидкость отсасываем и на предметное стекло переносим осадок, исследуя его под малым увеличением микроскопа.

Метод Дарлинга комбинирует процедуры осаждения и флотации. Фекалий смешивают с водой и центрифугируют 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку прибавляют жидкость Дарлинга (глицерин с насыщенным раствором хлористого натрия, 1:1), тщательно размешивают и вторично центрифугируют 3-5 минут. Металлической петлёй снимаем плёнку на предметное стекло, накрываем покровным и исследуют.

Есть ещё много модифицированных методов исследования с целью обнаружения яиц гельминтов. Существуют стандартизированные методы Фюллеборна, Щербовича и др. При всех исследованиях берут одинаковую посуду, одно и то же время отстаивают и центрифугируют пробы, пользуются петлями одинакового диаметра и, сравнивая число яиц в поле зрения микроскопа или в одной капле поверхностной плёнки до и после обработки животных, судят об эффективности проведённой дегельминтизации. Наиболее простой и достаточно точной является методика, предложенная М.Ш.Акбаевым с использованием сетки, изготовленной из фотоплёнки после рентгеновских снимков. Кроме того, используются количественные гельминтоовоскопические исследования.

Метод Стола. В 100 мл колбочку наливают вначале 56 мл воды и отмечают снаружи на уровне её мениска. Потом наливают ещё 4 мл воды и делают новую отметку. Воду выливают, а в градуированную колбочку наливают 56 мл 0,1н раствора едкого натра, добавляют столько фекалий, чтобы уровень жидкости достиг отметки 60 мл. (4 см 3 фекалий), всыпают 10-15 бусинок, тщательно взбалтывают. Сразу же после взбалтывания градуированной пипеткой набирают 0,075 мл или 0,1 мл смеси, наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом, подсчитывая число яиц гельминтов. Количество яиц в 1 см 3 (1 г) фекалий, найденное число яиц умножают на 200 (если исследовали 0,075 мл смеси) или на 150 (если 0,1 мл смеси).

Гельминтоларвоскопические исследования применяются для диагностики диктиокаулёза, мюллериоза и др. протостронгилидозов, а также стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных и стронгилоидозов разных животных.

Метод Бермана и Орлова. 10 г фекалий помещают в воронки аппарата Бермана на металлической сетке или завёрнутые в кусочки марли. Заливают водой комнатной температуры и оставляют на 3-6 часов. За это время личинки выползают из пробы в жидкость и опускаются по трубке на дно пробирки. Жидкость из пробирки сливают и отсасывают. Осадок после встряхивания разливают на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении микроскопа. Личинки нематод подвижны и легко обнаруживаются.

Упрощённая модификация метода Бермана (по Шильникову). В стакан с водой кладут пробы фекалий и завёрнутые в марлевые салфетки. Через 3-6 часов пробы вынимают, жидкость отстаивают 10-15 минут, затем пипеткой отсасывают прозрачный слой воды. Затем каплю осадка пипеткой наносят на предметное стекло для микроскопии.

Метод седиментации с центрифугированием. (экспресс-методика по Котельникову и др.). 3-5 г фекалий кладут в пробирки с водой (20-25 о С) и центрифугируют (1000-1500 оборотов в минуту) 2 минуты. Затем воду сливаем, а осадок, встряхнув, выливают на предметное стекло и исследуют на наличие личинок.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков фекалий от овец, коз и добавляют воды температурой 40 о С. Через 4о минут шарики удаляют и исследуют под микроскопом жидкость, оставшуюся на стекле на наличие личинок нематод. Обнаруженных разными методами личинок необходимо дифференцировать.

Исследование крови по Куликову. Из ярёмной вены набирают 20 мл крови и добавляют 2 мл 3,8 % водного раствора лимонно-кислого натрия и отстаивают в течение 20-25 минут. Образуется 3 слоя: нижний – осевшие эритроциты, средний – лейкоциты и личинки нематод и верхний – сыворотка. Тонкой пипеткой, берут содержимое среднего слоя, наносят его каплями на предметное стекло, накрывают покровным и смотрят под микроскопом.

Исследование крови крупного рогатого скота (по Стюарду). Кожу освобождаем от волос, место дезинфицируем. Пинцетом оттягиваем кожу и кривыми ножницами отрезают поверхностный слой. Помещают на предметное стекло в каплю физраствора и тщательно расщепляют препаровальными иглами. Жидкость исследуют под микроскопом.

Исследование кожи лошадей по Р.С.Чеботарёву. На холке, плече, других местах выбирают участок кожи размером 5 см 2 , дезинфицируем спиртом. Захватываем кожу в складку, отрезаем кусочек толщиной 3-4 мм и площадью 2-3 см 2 . Срезы помещают в пробирке и заливают 2-3 мл физраствора и оставляют на несколько часов в термостате при 36-37 о С или при комнатной температуре. Затем содержимое пробирки выливаем на часовое стекло и исследуют под микроскопом, с целью обнаружения личинок онхоцерков.

Иммунобиологическая диагностика. В практике используют аллергические реакции для диагностики тканевых гельминтозов или, так называемых, ларвальных цестодозов, таких как эхинококкоз, ценуроз, цистицеркозы, а также нематодозов как трихинеллёза. Для этого применяют внутрикожную пробу. В качестве антигена рекомендуют жидкость из личинок (пузырей) или экстракты из трихинелл и их личинок.

В настоящее время большое внимание уделяют разработке и использованию серологических реакций, используя в качестве антигенов живых личинок гельминтов. По этому принципу ставят реакции микропреципитации на живых личинках нематод при нематодозах, на церкариях — при трематодозах, на онкосферах и сколексах — при ларвальных цестодозах. Другой принцип серологических реакций связан с использованием соматических антигенов. Применяют реакции гемагглютинации и флоккуляции (агглютинации) с адсорбированными антигенами. В качестве адсорбентов используют кармин, бентонит и латекссинтетическая смола.

Разновидностью серологических реакций являются: реакция сколексопреципитации (РСкП), разработанная Р.С.Шульц и Р.Г.Исмагиловой для диагностики эхинококкоза овец. Другие реакции: РНГА, РЗГА и др.

Диагностическая дегельминтизация является методом макрогельминтоскопи-ческого исследования. Используют её при подозрении на мониезиоз, тизаниезиоз, авителлиноз жвачных, аноплоцефалидозы лошадей, тениидозы плотоядных, дрепанидотениоз водоплавающих птиц, аскаридоз свиней, аскаридиоз кур и др. небольшой группе животных; наиболее подозрительных в заболевании, вводят соответствующий антгельминтик в лечебной или заниженной дозе. За животными наблюдают и проверяют все выделенные экскременты с целью обнаружения гельминтов или их фрагментов, которые в дальнейшем исследуют.

И, наконец, методы исследования других органов.

Исследование мочи: при диоктофимозе почек, капилляриозе мочевого пузыря. Мочу следует предварительно просмотреть макроскопически или при помощи лупы на наличие гельминтов или их фрагментов. Мочу разбавляют пополам дистиллированной водой и центрифугируют 2-3 минуты, жидкость сливают, а осадок наносят на предметные стёкла и исследуют.

Исследование содержимого трахеи птиц: в ней хорошо видны сингамусы или циатостомы, которые обычно имеют яркокрасный цвет.

Исследование камеры глаза. Прижизненная диагностика сетариоза глаз лошадей и крупного рогатого скота — проводят макроскопическим исследованием передней камеры поражённого глаза, где можно видеть свободноплавающих сетарий (5-10 см) и хорошо просвечивает даже через помутневшую роговицу.

Исследование поверхностного соскоба с перианальных складок: палочку или спичку, смоченную 50 % водным раствором глицерина делают соскоб с перианальных складок с внутренней стороны корня хвоста и с области промежности. Соскоб переносят на предметное стекло в 2-3 капли глицерина (1:1 в воде), покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом на наличие яиц оксиурат.

Методы посмертной диагностики гельминтозов

— патологогистологические исследования. Посмертная диагностика гельминтозов различных стадий их развития в органах и тканях животных. Наиболее совершенная методика гельминтологического вскрытия разработана К.И.Скрябиым. Различают полное и неполное гельминтологическое вскрытие.

Полное гельминтологическое вскрытие – наиболее надёжный метод, позволяющий производить как количественный, так и качественный учёт всех гельминтов, которыми инвазировано животное.

Суть данного метода: после снятия с трупа кожи, тщательно осматривают подкожную клетчатку, затем вскрывают грудную и брюшную полости и извлекают все органы систем: пищеварительную, дыхательную систему, кровеносную, мочеполовую и др.

Органы отделяют и исследуют порознь, при этом используют метод последовательных смывов. Паренхиматозные органы (печень, лёгкие, поджелудочная железа, почки и др.) помещают в отдельную посуду и превращают в фарш, разрывая руками или разрезая на мелкие кусочки ножом или ножницами. Далее этот детрит отмывают водой или физраствором, пользуясь методом последовательных смывов. Полученный осадок изучают небольшими порциями сначала в чёрных, а затем в белых кюветах или в чашках Петри на чёрном и белом фоне. Крупных гельминтов выбирают визуально, а мелких – при помощи ручной лупы с 8-10-кратным увеличением. Собирают гельминтов только кисточкой или препаровальными иглами, но не пинцетом и непальцами.

НПГВ – упрощённое гельминтологическое вскрытие, в процессе которого извлекают из органов и тканей лишь отдельных резко выделяющихся по размерам гельминтов. Его используют также для получения музейного материала.

Гельминтологические исследования объектов внешней среды. Сбор консервирование и пересылка гельминтов. Фиксация, окраска гельминтов и приготовление из них постоянных микропрепаратов. Приготовление музейных макропрепаратов. Лабораторная диагностика трематодозов. Диагностика: фасциолёза, дикроцелиоза, описторхоза, парамфистоматоза, простогонимоза птиц, эхиностомоза уток и гусей.

Методы гельминтологических исследований делятся на прямые и косвенные. Прямые методы: выявление самих гельминтов, их фрагментов, яиц, личинок в фекалиях, моче, дуоденальном секрете, мокроте, носовой и влагалищной слизи, содержимом подногтевых пространств, биопсированных кусочках ткани. Косвенные методы: выявление вторичных изменений, возникающих в организме человека в результате жизнедеятельности паразита, серологическими реакциями, общим исследованием крови, мочи. Наиболее распространенными методами исследования фекалий являются гельминтоовоскопические и протозооскопические. При диагностике нельзя каким-либо одним методом выявить яйца или личинки всех видов гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека. Так, при использовании метода флотации в поверхностную пленку не всплывают (из-за высокого удельного веса) яйца трематод, в некоторых случаях неоплодотворенные яйца аскарид. В кале очень редко можно обнаружить яйца остриц, онкосферы тениид, которые выявляются специальными методами исследований: соскоб с перианальных складок для остриц и тениид, методы осаждения для трематод (яйца описторха и др.). Поэтому для целенаправленного обследования больного на гельминтозы врач в направлении должен указать, на какие гельминты следует обратить основное внимание (диагноз), что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления данного вида гельминта. Фекалии, взятые из разных мест испражнений в количестве не менее 50 граммов (чайная ложка) в чистую стеклянную посуду, должны быть отправлены в лабораторию не позднее чем через сутки после дефекации и исследованы в день поступления. В случае необходимости сохранения кала до следующего дня его помещают в холодное место (0-4°С) или заливают одним из консервантов. Перед исследованием кал перемешивают палочкой, чтобы яйца гельминтов оказались равномерно распределенными в общей массе. При обнаружении в препарате яиц какого-либо гельминта просмотр не прекращают, т.к. может быть двойная или тройная инвазия. Контроль за эффективностью лечения гельминтозов осуществляется путем исследования фекалий на яйца гельминтов через 2-3 недели или через 2-3 месяца после лечения в зависимости от обнаруженного гельминта. Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы. Часто на поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; выделяются с калом аскариды; иногда люди сами замечают отхождение гельминтов. У больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде "белых обсечек") или они активно выползают из анального отверстия. Макроскопический метод является основным для дифференциальной диагностики тениидоза и тениаринхоза (в сочетании с опросом). Из специальных макроскопических методов применяется метод последовательного промывания фекалий. Фекалии размешиваются в воде для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении их тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы, крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, и рассматривают их под лупой между двумя предметными стеклами. Мелких гельминтов или головки цестод рассматривают под лупой в капле глицерина или под микроскопом. При использовании этого метода для диагностики члеников свиного, бычьего цепней, широкого лентеца отмытые членики помещают между двумя стеклами и, просматривая на свет под лупой или малым увеличением микроскопа, определяют видовую принадлежность по строению матки (у зрелого членика свиного цепня от центрального ствола отходят 8-12 боковых ответвлений, а у бычьего цепня 18-32, чаще 28-32, у широкого лентеца членики больше в ширину и матка в центре в виде "розетки"). Если матку плохо видно, то ее предварительно можно подержать некоторое время в 50% растворе глицерина, после чего даже запустевшие стволы матки просматриваются хорошо. При определении этих цестод по строению отошедших головок их с шейкой осторожно кладут в каплю глицерина между предметными стеклами (или покрывают покровным стеклом) и, не передавливая, рассматривают под микроскопом при малом увеличении.

Микроскопические методы подразделяются на простые, сложные и специальные.

К простым относятся методы нативного мазка, нативный мазок раствором Люголя, методы толстого мазка под целлофаном по Като, закручивания (по Шульману) и перианального соскоба.

Сложные методы являются более эффективными и основаны на концентрации яиц в препаратах. Они включают в себя предварительную обработку фекалий жидкими реактивами, в результате чего яйца гельминтов или выпадают в осадок, или всплывают на поверхность жидкости.

К сложным методам относятся методы обогащения:

а) флотационные (когда удельный вес яиц меньше удельного веса солевого раствора и яйца всплывают в поверхностную пленку);

б) седиментационные (когда удльный вес яиц больше удельного веса солевых растворов и яйца оседают в осадок).

Специальными методами обнаружения яиц и личинок гельминтов, цист и вегетативных форм простейших являются методы соскоба, флотации, седиментации, ларвоскопии, протозооскопии, исследование желчи и методы окраски мазков кала, мокроты и др.

Для обнаружения фрагментов гельминтов фекалии просматривают невооруженным , затем смешивают с водой и исследуют небольшими порциями в чашке Петри на темном фоне. Все подозрительные частицы помещают на предметное стекло в каплю воды и исследуют под лупой. Можно суточную порцию поместить в цилиндр с добавлением 5-10-кратного количества воды. После размешивания сосуд оставляют до полного осаждения взвешенных частиц. Поверхностный слой жидкости сливают и наливают чистую воду. Отмытый осадок просматривают небольшими порциями в невооруженным глазом или под лупой. Для обнаружения яиц применяют микроскопические методы исследования.

Метод нативного мазка. Небольшое количество кала из разных мест исследуемой порции растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина, изотонического раствора хлорида натрия или воды. Смесь накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом.

Метод всплывания по Фюллеборну. Одну часть испражнений размешивают в 20 частях насыщенного раствора хлорида натрия (удельный вес 1,18), добавляемого небольшими порциями. Всплывшие на поверхность крупные частицы немедленно удаляют, а смесь оставляют на 45 мин. В течение этого времени яйца гельминтов, имеющие меньший удельный вес, чем раствор хлорида натрия, всплывают на поверхность. Поверхностную пленку снимают проволочной петлей диаметром около 1 см и переносят на предметное стекло для исследования под микроскопом.

Метод Калантарян. Эффективность метода всплывания повышается при замене хлорида натрия насыщенным раствором азотнокислого натрия. В этом случае смесь выдерживают 10-15 мин.

Поверхностную пленку, образующуюся после отстаивания смеси кала с раствором хлорида натрия или азотнокислого натрия, можно снимать и предметным стеклом. С этой целью баночку, налитую до краев смесью испражнений с раствором соли, накрывают предметным стеклом так, чтобы нижняя его поверхность соприкасалась с жидкостью. После отстаивания стекло снимают и, быстро повернув кверху поверхностью, на которой находится пленка, просматривают под микроскопом.

Соскоб сперианальных складок (для выявления яиц остриц и онкосфер бычьего цепня) делают утром до совершения туалета. Деревянным шпателем, смоченным в воде или в 50% растворе глицерина, производят соскабливание вокруг анального отверстия. Полученный материал переносят на предметное стекло в каплю воды или 50% раствора глицерина и просматривают под микроскопом. Шпатель можно заменить влажным ватным тампоном, которым протирают перианальную область, затем хорошо прополаскивают в воде. Воду центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Метод Берманна (для выявления личинок). Металлическую сетку с нанесенными на нее 5-6 г фекалий укрепляют на стеклянной воронке, вставленной в штатив. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом. Воронку наполняют водой, подогретой до t° 50°, так, чтобы нижняя часть сетки с калом соприкасалась с водой. Личинки активно переходят в воду и скапливаются в нижней части резиновой трубки. Через 4 часа жидкость спускают в центрифужные пробирки, центрифугируют и осадок просматривают под микроскопом.

Анализ мокроты, носовой слизи и влагалищных выделений для выявления яиц легочной трематоды парагонимуса, личинок аскарид и анкилостомид, яиц остриц, фрагментов эхинококкового пузыря. Исследуемую порцию слизи (выделений) намазывают на стекло и просматривают на черном и белом фоне макроскопически, а затем под микроскопом. Можно добавить к исследуемому материалу 25% раствор антиформина, тщательно взболтать и выдержать 1-1,5 часа в для растворения слизи. Смесь центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом.

Анализ дуоденального и желудочного сока для выявления яиц печеночных трематод, анкилостомид, личинок Strongyloides. Все три порции дуоденального содержимого, полученные при , центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. Так же исследуют и .

Исследование тканей. Для выявления личинок трихинелл кусочки биопсированной мышцы тщательно расщепляют на волоконца, сдавливают между компрессорными стеклами (толстые стекла с винтами) и исследуют под микроскопом с затененным светом. Для выявления цистицерков мышцы расслаивают препаровальными иглами, выделенный пузырек очищают от окружающей ткани, сдавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под лупой.

Анализ крови (для выявления личинок филярий). Исследуют висячую каплю на покровном стекле, окантованном вазелином. Можно 0,3 мл крови смешать с 10-кратным количеством 3% раствора . Смесь центрифугируют и осадок исследуют под микроскопом. Для обогащения препаратов к 1 мл венозной крови прибавляют 3 мл 2% раствора формалина или 5-кратное количество жидкости, состоящей из 95 мл 5% раствора формалина, 5 мл уксусной кислоты и 2 мл концентрированного спиртового раствора гематоксилина. Смесь центрифугируют, осадок промывают дистиллированной водой путем и исследуют под микроскопом. Для дифференцирования разных видов филярий исследуют мазки, окрашенные по методу Гимзы - Романовского.

Методы иммунологической диагностики. Применяют (агглютинации, связывания комплемента) и аллергические диагностические пробы (см.) с из соответствующего вида гельминта.

Гельминтологические методы исследования. Рис. Яйца гельминтов. 1-10 - яйца круглых червей (нематод): 1 - 3 - аскариды (1 - оплодотворенное яйцо, 2 - оплодотворенное яйцо без белковой оболочки, 3 - неоплодотворенное яйцо); 4 - аскариды кошачьей; 5 -аскариды плотоядных; 5 -острицы; 7 - власоглава; 8 - томинкса; 9 - анкилостомид; 10 - трихо-стронгилид. 11- 15 - яйца ленточных червей (цестод): 11 - цепня бычьего; 12 - цепня карликового; 13 - цепня крысиного; 14 - цепня тыквовидного; 15 -лентеца широкого. 16 - 24 - яйца сосальщиков (трематод): 16 - трематоды (шистосомы) японской; 17 - трематоды (шистосомы) моче - половой; 18 - трематоды (шистосомы) Мансона; 19 - трематоды (парогонимус) легочной; 20 - трематоды (описторхис) сибирской (кошачьей); 21 - трематоды (клонорхис) китайской; 22 - трематоды (метагонимуса) кишечной; 23 - трематоды (фасциолы) печеночной; 24 - трематоды (дикроцелиум) ланцетовидной.

Подразделяются простейшие на 4 класса:

При инцистировании микроорганизм приобретает округлую форму и покрывается защитной оболочкой. В форме цисты простейшие становятся маловосприимчивыми к неблагоприятным факторам среды.

Исследованию могут подвергаться:

Обратите внимание: разновидностей диагностики очень много, мы рассмотрим те виды, которые наиболее распространены в клинической лабораторной практике.

Частные виды диагностики

В каждом конкретном случае перед лаборантом ставится задача нахождения определенного возбудителя, иногда попутно с основным обнаруживаются и другие.

Насчитывается 6 видов этого микроорганизма, способного к обитанию в кишечнике человека. Клиническое значение имеет только дизентерийная амёба, встречающаяся в вегетативной форме и в виде цист.

Дополнительно применяются иммунологические методы:

• непрямой иммунофлюоресценции;
• непрямой агглютинации (РНА);
• радиальной иммунодиффузии.

Обратите внимание: серологические методы малоинформативны и применяются лишь как дополнение к основным в сомнительных случаях.

Диагностика ресничных (инфузорий)

Патогенная форма микроорганизмов этого рода – балантидий. Это микроб, вызывающий балантидиаз – болезнь, сопровождающуюся язвенным процессом толстого кишечника. Возбудитель обнаруживается в нативном мазке в виде вегетативной формы и цисты. Материал для мазка (кал и слизь) забирается при ректороманоскопическом исследовании и высевается на специальные среды.

Диагностика жгутиконосцев (лейшманий, лямблий, трипаносом, трихомонад)

Для человека представляют опасность лейшмании, трипаносомы, лямблии, трихомонады.

Лейшмании – микробы, вызывающие лейшманиоз, исследуются в мазках крови, материалах костного мозга, соскобов из кожных инфильтратов. В некоторых случаях при диагностике лейшманий применяется посев на питательные среды.

Трипаносомы – возбудители сонной болезни (американский/африканский трипаносомоз, или болезнь Шагаса).

Африканский вариант определяют в начальном периоде при исследовании периферической крови. Патологические микробы при прогрессировании болезни находятся в материале пункций лимфоузлов, в запущенных стадиях – в спинномозговой жидкости.

Для диагностики трипаносом при подозрении на болезнь Шагаса исследуемый материал обследуется под микроскопом при малом увеличении. При этом мазки и толстую каплю предварительно окрашивают.

Трихомонады (кишечная, ротовая, ) обнаруживаются при микроскопии материалов, взятых из пораженных слизистых оболочек.

Выявление споровиков (малярийного плазмодия, возбудителя кокцидоза и пр.)

Наиболее распространенный и опасный для человека вид – малярийный плазмодий, имеющий 4 основные разновидности возбудителя: возбудитель трехдневной малярии, четырехдневной малярии, тропической малярии и малярии овале.

Половое развитие плазмодия (спорогония) проходит в комарах Анофелес. Бесполое (тканевая и эритроцитарная шизогония) – в печеночной ткани и эритроцитах человека. Эти особенности жизненного цикла обязательно учитываются при диагностике малярийного плазмодия.

Так, у только что заболевшего больного в крови можно обнаружить половые клетки цикла спорогонии. А вот на высоте малярийных приступов в крови в большом количестве появляются шизонты.

Более того, в разные фазы малярийной лихорадки проявляются различные формы плазмодия:

• в период озноба кровь наполняется мерозоитами, разновидностью шизонтов;
• на высоте температуры в эритроцитах скапливаются кольцевидные трофозоиты;
• снижение температуры характеризуется преобладанием амебовидных трофозоитов;
• в периоды нормального состояния кровь содержит взрослые формы шизонтов.

Исследование возбудителя малярии (малярийного плазмодия) проводится в мазке и в толстой капле.

Обратите внимание: диагностика малярии при исследовании мазков и толстых капель крови иногда бывает ошибочной. Тромбоциты крови в некоторых случаях могут ошибочно быть причислены к малярийному возбудителю. Также иногда симулируют плазмодий фрагменты лейкоцитов и других клеток.

Основные методы исследования простейших

Кратко ознакомимся с самыми распространенными методами исследования на наличие простейших.

Диагностика простейших методом нативного мазка и мазка, окрашенного раствором Люголя (в кале)

Препарат готовится из эмульсии кала в изотоническом растворе. На предметное стекло наносятся две капли натрия хлора и рядом раствор Люголя. В оба состава деревянной палочкой добавляют исследуемый материал и после накрывания стеклом просматривают в разных разрешениях микроскопа.

По определенным признакам регистрируют найденных простейших. Для точности готовят 2-3 препарата из одного материала. В сомнительных случаях анализ повторяют несколько раз на протяжении 2-3-х недель.

Методом можно обнаружить вегетативные и цистные формы:

• лямблий;
• балантидий;
• дизентерийной амебы.

Вместе с патогенными формами определяются и непатогенные простейшие. Также у здоровых носителей находятся просветные и цистные формы.

Важно: исследования во избежание неточностей и ошибок следует проводить неоднократно.

Результат диагностики простейших методом нативного и окрашенного мазка должен содержать описание формы возбудителя (просветная, циста, тканевая).

Требования к исследованию:

• забранный на анализ материал (жидкий кал) исследуется не позднее 30 минут после дефекации;
• оформленный кал необходимо подвергнуть диагностике в течение 2 часов после дефекации;
• в материале не должно быть примесей (дезинфицирующих средств, воды, мочи);
• для работы с материалом используют только деревянные палочки, стеклянные не пригодны из-за соскальзывания слизи;
• палочки после использования немедленно необходимо сжигать.

Метод консервации (исследование кала) при диагностике простейших

Исследование проводится путем фиксации простейших с консервантом. Отличие этого метода от предыдущего в том, что консерванты позволяют сохранить препарат в течение длительного периода.

Используемые консерванты:

• Барроу. Содержит консервирующие ингредиенты: 0,7 мл хлорида натрия, 5 мл формалина, 12,5 мл 96% спирта, 2 г фенола и 100 мл дистиллированной воды. Красящий состав: 0,01% раствор тионина (азура).
• Раствор Сафарлиева. Состав: 1,65 г сульфата цинка, 10 мл формалина, 2,5 г кристаллического фенола, 5 мл уксусной кислоты, 0,2 г метиленового синего, 100 мл воды. Этот консервант используется в случаях, когда материал должен храниться более месяца.

Консервантом наполняются пустые флаконы, в них переносят материал, в пропорциях 3:1, затем при необходимости добавляют краситель. Оценка результатов производится при исследовании 2-3-х препаратов.

Метод формалин-эфирного обогащения (анализ на наличие простейших в кале)

Этот способ диагностики позволяет отделить и сконцентрировать цисты простейших. Для анализа нужны следующие ингредиенты: формалин (10 мл), 0,85 г изотонического раствора, дистиллированная вода, серный эфир, раствор Люголя.

Смесь биоматериала с перечисленными жидкостями смешивают и центрифугируют. Полученный на дне пробирки осадок окрашивают раствором Люголя и исследуют на предмет наличия цист и вегетативных форм.

Метод нахождения лейшманий (мазок костного мозга)

Для диагностики лейшманиоза используются реактивы: смесь Никифорова (серный эфир и этиловый спирт), фосфатный буфер, Азур-эозин по Романовскому.

Вещество костного мозга очень осторожно помещают на предметное стекло после специальной подготовки. Используется микроскоп с иммерсионной системой.

В острый период болезни в пунктате обнаруживается большое количество лейшманий.

Обратите внимание: иногда кровяные клетки могут напоминать обработанные лейшмании, поэтому очень важно лаборанту быть внимательным и иметь достаточный опыт для самостоятельного исследования.

Метод обнаружения лейшманий в мазке из кожного инфильтрата

Необходимые реактивы аналогичны предыдущему анализу.

Исследуемый материал получают из имеющегося бугорка или язвенного содержимого. Соскоб при подозрении на лейшманиоз делается очень аккуратно скальпелем, без крови. Затем готовится препарат на стекле. Для точности получаемых результатов одновременно подвергают осмотру несколько препаратов.

При наличии заболевания среди присутствующих в исследуемом материале макрофагов, фибробластов, лимфоидных клеток определяются и лейшмании.

Метод выделения чистой культуры лейшманий, полученных путем соскоба патологических тканей

При этом способе диагностики простейших соскоб тканей помещают в специальную питательную среду, в которой происходит активное размножение лейшманий.

Перед забором соскоба кожу тщательно обрабатывают спиртом, затем делается надрез бугорка, со дна которого извлекается содержимое и помещается в пробирку со средой. Материал забирается несколько раз, после чего он помещается в разные пробирки. Затем в термостате при температуре 22-24 градуса происходит культивирование. Результаты оценивают под микроскопом. Этот метод применяется, когда другие, более дешевые и быстрые способы диагностики простейших неэффективны.

Увидеть, как на практике расшифровываются анализы на наличие простейших по капле крови, вы сможете, посмотрев видео-обзор:

Лотин Александр, медицинский обозреватель

Медицинское значение имеют три группы гельминтов-нематоды (круглые черви), цестоды (ленточные черви) и трематоды (сосальщики).

Для видовой идентификации яиц гельминтов используются следующие признаки.

1. Размеры . Измеряют длину и ширину яиц, которые обычно имеют определенную у каждого вида величину.

2. Форма . Для каждого вида характерна своя особая форма яиц.

3. Стадия развития при выделении во внешнюю среду . У одних Видов яйца состоят из одной клетки; у других в яйце может быть несколько клеток; у третьих яйца обычно эмбрионированы (т.е. они содержат личинки) при выделении с фекалиями во внешнюю среду. Иногда, если пробы фекалий исследуют через несколько часов или спустя 1-2 дня после дефекации, яйца гельминтов развиваются до более взрослых стадий. В идеале на анализ следует принимать только свежие пробы фекалий.

4. Толщина оболочки яйца. Яйца некоторых видов, например аскарид, имеют толстую оболочку; у других видов гельминтов, например у анкилостомид, оболочка яиц тонкая.

6. Наличие морфологических особенностей , таких, как крышки, шипы, пробки, крючочки или фестончатая наружная оболочка.

При обнаружении яйца гельминта или похожего на него объекта следует тщательно оценить все перечисленные выше признаки, чтобы установить видовой диагноз.

Для того чтобы установить видовую принадлежность яиц гельминтов, необходимо определить их размер, форму, стадию развития, толщину оболочки, цвет и наличие морфологических особенностей, таких, как крышечки, шипы, пробки, крючочки и бугристая наружная оболочка.

Для установления видового диагноза используют специальные определители и схематические изображения яиц гельминтов.

Рис. 34.2. Относительная величина, форма и структура яиц гельминтов.

1. ИССЛЕДОВАНИЕ ИСПРАЖНЕНИЙ.

Гельминтологические исследования проводятся с целью диагностики гельминтозов путем обнаружения в патологическом материале яиц, личинок, взрослых гельминтов или их фрагментов. Поскольку большинство гельминтов в половозрелой стадии развития находится в желудочно-кишечном тракте или в сообщающихся с ним органах, чаще всего применяются макро- и микрогельминтоскопические методы исследования фекалий (не более суточной давности).

С целью повышения достоверности обследования анализы должны быть повторены несколько раз ежедневно с промежутком 1-3 дня.

1.1. МАКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИСПРАЖНЕНИЙ

Метод отстаивания . Суточную порцию фекалий тщательно промывают водой, пока вода над осадком не станет прозрачной. Слив верхний слой, переносят осадок в чашку Петри и на темном фоне просматривают его под лупой или невооруженным глазом.

Метод отсеивания. Перемешанные с водой фекалии помещают на систему сит специального прибора. После промывания водопроводной водой сита переворачивают и, смыв содержимое в чашки Петри, просматривают невооруженным глазом или под лупой.

1.2. МИКРО ГЕЛЬМИНТОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используют гельминтоовоскопические и гельминтоларвоскопические методы с целью обнаружения яиц гельминтов и их личинок.

1.2.1. ГЕЛЬМИНТООВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

При использовании гельминтоовоскопических методов обнаружения гельминтов вначале готовят двоякого рода мазки – нативный и толстый .

Þ Нативный мазок. Небольшое количество фекалий растирают на предметном стекле в капле 50%-ного раствора глицерина или кипяченой воды. Крупные частицы осторожно удаляют, смесь накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (просматривают два мазка).

Делая нативный мазок, следует знать, что при слабых инвазиях в нем редко обнаруживаются яйца гельминтов.

Þ Толстый мазок с целлофаном по Като. Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Подготовленный толстый мазок фекалий покрывают кусочком целлофана, смоченного смесью глицерин-фенол влажного целлофана. Препарат исследуют через 30–60 мин, когда он слегка подсохнет и просветлится, вследствие чего яйца гельминтов легко обнаружатся под малым увеличением микроскопа.

В большом мазке хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже – прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден.

Þ Методы обогащения

Среди методов обогащения используют методы флотации (всплывания) и седиментации (осаждения).

А). Методы флотации основаны на применении насыщенных растворов различных химических веществ, в которых яйца всплывают благодаря разнице удельного веса.

Метод всплывания по Фюллеборну основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия (удельный вес 1,18), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка. Достоинствами является доступность и дешевизна. Данный метод хорошо выявляет яйца нематод и карликового цепня.

Однако яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Поэтому требуется обязательно исследовать не только поверхностную пленку, но и осадок, что усложняет метод. К недостаткам относится и замедленное всплывание яиц: яйца карликового цепня всплывают через 15-20 мин, аскарид – через 1,5-2 часа, власоглава – через 2-3 часа.

Метод Е.В.Калантарян также метод обогащения, но более эффективен и проще. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностно пленке, исследование осадка не требуются.

Недостаток метода – дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке.

Б). Метод осаждения (седиментации) яиц гельминтов основаны на использовании химических веществ, растворяющих жиры и белки фекалий.

Метод П.П.Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод.

Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метода Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуются методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.

1.2.2. ГЕЛЬМИНТОЛАРВОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ (выявление личинок)

Метод закручивания по Е.С.Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоидов . Исследуют только свежевыделенные фекалии, которые размешивают палочкой в 5-кратном количестве воды. Через 20-30 ск после начала размешивания палочку быстро вынимают, образовавшуюся на ее конце каплю жидкости переносят на предметное стекло и микроскопируют.

Метод Берманна основан на способности личинок гельминтов мигрировать по направлению к теплу и служит для их выявления в фекалиях, в первую очередь при подозрении на стронгилоидоз.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДРУГИХ ЭКСКРЕТОВ И СЕКРЕТОВ

В дуоденальном содержимом микроскопируют имеющиеся в нем хлопья и плотные включения, а затем, разлив его по пробиркам, добавляют равный объем серного эфира, центрифугируют и исследуют осадок.

В рвотных массах изредка обнаруживаются гельминты или их фрагменты (например, при прорыве нагноившейся эхинококковой кисты из легкого в бронхи с рвотой выделяется светлая водянистая или гнойная жидкость). Диагноз ставится на основании обнаружения обрывков кутикулярной оболочки, сколексов и крючьев эхинококка.

Исследование мочи.

Мочеполовой шистосомоз диагностируют путем выявления яиц и мирацидиев. Яйца возбудителя мочеполового шистосомоза (Schistosoma haemotobium) крупные и достигают в длину 120-150 мкм, они имеют терминальный шип на одном конце. Внутри яйца можно увидеть зародыш (мирацидий). Иногда возникает необходимость установить, являются ли обнаруженные яйца жизнеспособными. Это можно определить, если препарат свежий и к нему не добавлялись консерванты. При хронической форме шистосомоза у больных к концу мочеиспускания выделяется кровь, но яйца в моче находят редко, вследствие чего рекомендуется прибегать к биопсии мочевого пузыря.

Яйца парагонимуса, обитающего преимущественно в легких, в случае локализации в почке, мочеточниках, стенках мочевого пузыря попадают в мочу. В хилезной моче выявляются микрофилярии.

Исследование мокроты.

В мокро те могут находиться яйца парагонимусов, шистосом, личинки мигрирующих нематод, фрагменты эхинококкового пузыря. При некоторых гельминтозах в мокроте наблюдаются характерные изменения. При парагонимозе , например, в мокроте можно обнаружить скопления яиц в виде желтоватых комочков.