ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Химический факультет

Курсовая работа на тему
«Масс-спектрометрический метод анализа»

Выполнил: студент группы Х-202
Меньшенин А.Н.

Проверила: Данилина Е.И.

Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D – больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.

Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.

Двуфокусирующий магнитный сектор

Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m / z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m / z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и

MALDI.

Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия

Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7 ) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия – всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ½ mv 2 , скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ½ . Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m / z . В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ½ , принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t 2 KE/d 2 , где KE=const .

Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8 ) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение Δt. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/Δm (или t/Δt, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение Δt приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m / z свыше 5000).

Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI – фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10 ).

Нужно заметить, что электроспрей также был адаптирован под TOF рефлектронные анализаторы, в которых ионы из непрерывного ESI-источника накапливаются в гексаполярном (или октаполярном) ионопроводе, а затем выталкиваются в TOF анализатор. Тем самым, необходимая электростатическая импульсность создаёт точку отсчёта, с которой можно начинать измерения TOF.

MALDI и времяпролётный анализ

На начальных этапах развития MALDI-TOF, эти приборы имели относительно низкое разрешение, которое серьёзно ограничивало их точность. Нововведением, которое оказало существенный эффект на увеличение разрешающей силы MALDI времяпролётных приборов было отложенное извлечение (DE), как показано на рис. 2.11 . В теории, отложенное извлечение означает просто охлаждение и фокусировку ионов сразу после акта MALDI, но на практике сначала было проблемой включать и выключать импульсы в 10000 вольт за наносекунды.

В традиционных приборах MALDI, ионы ускоряются из устройства ионизации сразу после образования. Однако, отложенное извлечение ионов позволяет им «остыть» в течение ~150 наносекунд перед ускорением в анализатор. Этот период охлаждения генерирует набор ионов с гораздо меньшим распределением кинетической энергии, значительно уменьшая временной разброс ионов, когда они входят в TOF анализатор. В общем, это приводит к увеличению разрешения и точности. Выгоды отложенного извлечения значительно сокращаются для больших макромолекул, таких как белки (>30000 Да).

Квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия

Квадрупольные времяпролётные анализаторы масс обычно совмещаются с устройствами ионизации электроспрея, а в последнее время успешно совмещаются с MALDI. ESIquad-TOF (рис. 2.12 ) комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой эффективностью, чувствительностью и точностью времяпролётного рефлектронного анализатора масс. Квадруполь может выступать как простой квадрупольный анализатор, чтобы сканировать определённый диапазон m / z . Однако он может быть также использован, чтобы селективно выделить ион-прекурсор и направить его в ячейку столкновения. Получившиеся фрагментарные ионы затем анализируются TOF рефлектронным анализатором масс. Квадрупольный TOF использует способность квадруполя выделять отдельный ион и способность TOF-MS совершать одновременное и точное измерение ионов по всему диапазону масс за короткий период времени. Квадрупольные TOF анализаторы выдают большую чувствительность и точность, нежели тандемные квадрупольные приборы при получении полных фрагментарных масс-спектров.

Квадрупольный TOF прибор может использовать квадрупольный или TOF анализаторы независимо или совместно для тандемных MSэкспериментов. TOF компонент прибора имеет больший m / z предел, превышающий 10000. Высокая разрешающая сила (~10000) TOF также обеспечивает хорошую точность измерения массы – порядка 10 ppm. Из-за своей высокой точности и чувствительности, ESIquad-TOF масс-спектрометр внедряются в решение проблем протеомики и фармакокинетики.

Масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS)

FTMS основана на принципе наблюдения за орбитальным движением заряженных частиц в магнитном поле (рис. 2.13-14 ). Пока ионы движутся по орбитам, импульсный радиочастотный (RF) сигнал используется для их возбуждения. Это RF возбуждение позволяет ионам продуцировать заметный экранирующий ток, вводя их в когерентное движение и увеличивая радиус орбиты. Экранирующий ток, генерируемый всеми ионами, может быть затем Фурье-преобразован, чтобы получить составляющие частоты различных ионов, которые соотносятся с их m / z . Так как частоты могут быть определены с высокой точностью, соответствующие им m / z также могут быть вычислены с высокой точностью. Важно отметить, что сигнал генерируется только когерентным движением ионов в условиях ультравысокого вакуума (10 -11 -10 -9 Торр). Этот сигнал должен быть измерен за минимальное время (обычно от 500 мс до 1 секунды), чтобы обеспечить высокое разрешение. По мере увеличения давления, сигнал затухает быстрее, вследствие потери когерентности движения из-за столкновений (например, меньше чем за 150 мс) и не позволяет провести измерения с высоким разрешением (рис. 2.14 ).

Ионы, находящиеся в когерентном циклотронном движении между двумя электродами изображено на рис. 2.13 . По мере того, как положительно заряженные ионы двигаются от верхнего электрона и приближаются к нижнему, электрическое поле ионов вынуждает электроны внешней цепи течь и накапливаться на нижнем электроде. На другой половине циклотронной орбиты электроны покидают нижний электрод и накапливаются на верхнем электроде, когда ионы приближаются. Колебательное движение электронов внешней цепи называется экранирующим током. Когда смесь ионов с различными значениями m / z одновременно ускоряется, сигнал экранирующего тока на выходе усилителя представляет собой составной установившийся сигнал с составляющими частотам, соответствующими каждому значению m / z . Проще говоря, все ионы, запертые в ячейке анализатора, возбуждаются до высоких циклотронных орбит при помощи радиочастотного импульса. Составной установившийся сигнал экранирующего тока ионов по мере их релаксации обрабатывается компьютером, и используется преобразование Фурье для выделения индивидуальных циклотронных частот. Влияние давления на сигнал и разрешение продемонстрировано на рис. 2.14.

Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MS n). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.

FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>10 5) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16 , где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m / z ионов.

В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это – чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным.

Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями :

Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m / z , поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17 ).

Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m / z . Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.

Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10 -6 – 10 -7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10 -10 – 10 -9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.

Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.

Квадрупольный	Ионная ловушка	Времяпролётный	Времяпролётный рефлектрон	Магнитный сектор	FTMS	Квадрупольный TOF
Точность	0.01% (100 ppm)	0.01% (100 ppm)	0.02 to 0.2% (200 ppm)	0.001% (10 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	<0.0005% (<5 ppm)	0.001% (10 ppm)
Разрешение	4,000	4,000	8,000	15,000	30,000	100,000	10,000
Диапазон m/z	4,000	4,000	>300,000	10,000	10,000	10,000	10,000
Скорость сканирования	~ секунда	~ секунда	миллисекунды	миллисекунды	~ секунда	~ секунда	~ секунда
Тандемная MS	MS 2 (тройной квадруполь)	MS n	MS	MS 2	MS 2	MS n	MS 2

Возможности масс-спектрометрии

По масс-спектру можно определить молекулярную массу вещества. Это необходимо для установления молекулярной формулы вещества (брутто-формула). Масса атома, измеренная с высокой точностью, отличается от массового числа. Так, для CO 2 и C 3 H 8 массовое число равно 44, но их точные относительные молекулярные массы равны соответственно 43,989828 и 44,062600, т.е. разница составляет 0,072772 а.е.м. Масс-спектрометр позволяет разделить пучки ионов CO 2 + и C 3 H 8 + , когда они получаются одновременно.

Определение атомного состава по точному значению массы проводится с использованием таблиц точных масс для различных соотношений числа атомов C, H, O и N как наиболее распространённых элементов. Точное измерение масс не заменяет элементного анализа. Оба метода взаимно дополняют друг друга.

При исследовании масс-спектра дополнительно к определению типа молекулярного иона (М + ) измеряют пики и для изотопных ионов, включающих более легкие или более тяжелые изотопы (с массовыми числами М ± 1, М ± 2, М ± 3 и т.п.). Одновременное присутствие нескольких изотопов в молекуле маловероятно, т.к. естественная распространенность более тяжелых изотопов C, H, O и N незначительна. Например, 13 C: 12 C = 1×10 -2 ; 2 H: 1 H = 1,6×10 -4 ; 15 N: 14 N = 4×10 -3 и т.д. Однако для хлора 35 Cl: 37 Cl = 3:1; для брома 79 Br: 81 Br = 1:1. Следовательно, в масс-спектре наряду с ионом М + будет присутствовать ион (М+1) + с интенсивностью, пропорциональной распространенности изотопов. В широко используемых справочных таблицах приводятся обычно соотношения интенсивностей пиков молекулярных ионов с массовыми числами М+1 и М+2.

Максимальное значение m/z в масс-спектре вещества может иметь молекулярный ион (М + ), масса которого равна молекулярной массе исследуемого соединения. Интенсивность пика молекулярного иона (М +) тем выше, чем этот ион стабильнее.

Практически редко удается установить полную структуру соединения только на основе масс-спектра. Наиболее эффективно совместное использование нескольких физико-химических методов. Масс-спектрометрия, особенно в сочетании с хроматографией, является одним из наиболее информативных методов исследования структуры вещества (хроматомасс-спектрометрия).

Таким образом, возможности метода: определение молекулярной массы и брутто-формул веществ; установление строения вещества по характеру образующихся фрагментов; количественный анализ смесей, включая определение микропримесей; определение степеней чистоты вещества; определение изотопного состава вещества.

Рассмотрим в качестве примера масс-спектр этанола (рис. 2). Обычно спектр представляют в виде гистограмм.

Рис. 2. Масс-спектр этанола

В современных приборах обработка интенсивности электрических импульсов, соответствующих пикам с различающимися значениями m/z, производится с помощью компьютера.

Масс-спектры приводят в такой записи: указывают значения m/z, а в скобках относительную интенсивность (%). Например, для этанола:

С 2 H 5 OH-масс-спектр (m/z): 15(9), 28(40), 31(100), 45(25), 46(14).

Вопросы для собеседования

1. Теоретические основы метода.

2. Энергия ионизации. Типы фрагментации.

3. Принципиальная схема масс-спектрометра.

4. Методы ионизации: электронный удар, химическая ионизация и др.

5. Закономерности фрагментации молекулярного иона.

6. Возможности масс-спектрометрии.

Тестовые задания

1. Типы фрагментации молекулярного иона:

а). Диссоциация - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал, образуются фрагменты с четными значениями отношения m/z.

Перегруппировка - изменение последовательности связей, образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула, фрагменты характеризуются нечетным значением отношения m/z.

б) Перегруппировка - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал, образуются фрагменты с нечетными значениями отношения m/z.

Диссоциация - изменение последовательности связей, образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула, фрагменты характеризуются четным значением отношения m/z.

в) Диссоциация - распад молекулярного иона с сохранением последовательности связей. В результате процесса образуются катион и радикал, образуются фрагменты с нечетными значениями отношения m/z.

Перегруппировка - изменение последовательности связей, образуется новый катион-радикал меньшей массы и нейтральная устойчивая молекула, фрагменты характеризуются четным значением отношения m/z.

2. Возможности метода масс-спектрометрии:

а) определение молекулярной массы и брутто-формул веществ, количественный анализ смесей;

б) установление строения вещества по характеру образующихся фрагментов, определение изотопного состава вещества;

в) определение молекулярной массы и брутто-формул веществ; установление строения вещества по характеру образующихся фрагментов; количественный анализ смесей, включая определение микропримесей; определение степеней чистоты вещества; определение изотопного состава вещества.

3. Выберите правильный ответ:

а) Вероятность разрыва связи С-Н уменьшается с увеличением цепи углеводорода; энергия разрыва связи С-С меньше; в ароматических производных наиболее вероятен разрыв β-связи с образованием перегруппировочного тропилиевого иона;

а) Вероятность разрыва связи С-Н уменьшается с увеличением цепи углеводорода; энергия разрыва связи С-С больше; в ароматических производных наиболее вероятен разрыв β-связи с образованием перегруппировочного тропилиевого иона;

в) Вероятность разрыва связи С-Н уменьшается с увеличением цепи углеводорода; энергия разрыва связи С-С меньше; в ароматических производных наиболее вероятен разрыв a-связи с образованием перегруппировочного тропилиевого иона;

1. Казин В.Н., Урванцева Г.А. Физико-химические методы исследования в экологии и биологии: учебное пособие (гриф УМО) / В.Н. Казин, Г.А. Урванцева; Яросл. гос. ун-т им. П.Г. Демидова. - Ярославль, 2002. - 173 с.

2. Под. ред. А.А. Ищенко. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа / Н.В. Алов и др. - М.: Издательский центр «Академия», 2012. (в 2-х томах, 1 том -352 с., 2 том - 416 с.) - (Сер. Бакалавриат)

3. Васильев В.П. Аналитическая химия. - кн. 2. Физико-химические методы анализа. М.: Министерство образования РФ. 2007. 383 c.

4. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия, кн. 1, кн. 2, Высшая школа, 2008.

5. Отто М. Современные методы аналитической химии (в 2-х томах). Москва: Техносфера, 2008.

6. Под ред. Ю.А. Золотова. Основы аналитической химии, Высш.шк., 2004.

7. Васильев В.П. Аналитическая химия. - кн. 2. Физико-химические методы анализа. М.: Дрофа, 2009.

8. Казин В.Н.Физико-химические методы анализа: лабораторный практикум / В.Н. Казин, Т.Н. Орлова, И.В. Тихонов; Яросл. гос. ун-т им. П.Г. Демидова.- Ярославль: ЯрГУ, 2011. – 72 с.

Что происходит с образцами крови, которую вы сдаете на клинический анализ? Сколько весит ваш гемоглобин? Каким образом ученые вообще взвешивают молекулы - мельчайшие частицы вещества, которые невозможно увидеть или потрогать? Обо всем этом в рамках рубрики «Просто о сложном» T&P рассказала студентка 5-го курса кафедры химической физики ФМХФ, сотрудница лаборатории ионной и молекулярной физики МФТИ Екатерина Жданова.

Очень часто методы исследований интересуют лишь специалистов в конкретных областях и остаются в тени более фундаментальных проблем, например происхождения жизни или принципов работы человеческого сознания. Тем не менее для поиска ответа на «главный вопрос жизни, Вселенной и всего остального» сначала необходимо научиться отвечать на вопросы более простые. Например, как взвесить молекулу? 

Обычные весы тут вряд ли помогут: масса молекулы метана - около 10^(-23) грамм. Молекула гемоглобина, крупного и сложного белка, весит в несколько раз больше - 10^(-20) грамм. Ясно, что необходим какой-то иной подход к проблеме, ведь привычные нам измерительные приборы к ней не применимы. Надо также понимать, что, взвешивая в магазине яблоки или становясь на весы после тренировок, мы на самом деле измеряем силу, действующую на прибор - весы. Затем уже происходит пересчет в привычные нам единицы - граммы и килограммы.


Но как же взвесить молекулу? Здесь природа оставила нам лазейку. Оказывается, заряженные частицы «чувствуют» присутствие электрического и магнитного поля и изменяют траекторию и характер своего движения. На заряженные частицы также действуют силы, величину которых можно пересчитать в отношении массы к заряду.
Этот метод сегодня довольно популярен и называется масс-спектрометрия. Первооткрывателем масс-спектрометрии считается сэр Дж. Дж. Томсон, нобелевский лауреат по физике. Он обратил внимание на то, что заряженные частицы движутся в магнитном поле по параболическим траекториям, пропорциональным отношению их массы к заряду.

Схема работы масс-спектрометра состоит из нескольких этапов. Прежде всего анализируемое вещество должно пройти ионизацию. Затем оно попадает в систему ионного транспорта, которая должна доставить заряженные частицы в масс-анализатор. В масс-анализаторе как раз происходит разделение ионов в зависимости от отношения массы к заряду. В завершение ионы попадают на детектор, данные с которого анализируются с помощью специального программного обеспечения. Полученная таким образом картинка представляет собой спектр, то есть распределение частиц. Одна из осей этого графика - отношения массы к заряду, вторая - интенсивность. Каждый из пиков на таком графике будет характерным для ионов конкретного вещества, поэтому попадание в прибор посторонних веществ, например воздуха, может привести к искажениям результатов. Чтобы избежать этого, применяется вакуумная система.

Сравнительно простая физическая концепция данного метода требует ряда нетривиальных инженерных решений. Как ионизировать молекулы? Каким способом создавать электромагнитное поле? 
Атомы и молекулы электрически нейтральны, поэтому для проведения масс-спектрометрических измерений необходимо их ионизировать, то есть оторвать электроны с внешних атомных орбиталей или добавить протон. Важную роль играет тип образца, с которым предстоит работать. Для исследования неорганических веществ - металлов, сплавов, горных пород - необходимо использовать одни методы, для органических веществ подходят другие. Очень многие органические вещества (такие как ДНК или полимеры) сложно испарить, то есть перевести в газ, без разложения, а это значит, что исследования живой ткани или биологических образцов требуют применения специальных методов. Кроме того, при ионизации молекулы могут распадаться на отдельные фрагменты. Так мы снова встаем перед вопросом: что именно мы собираемся измерить? Массу всей молекулы или массу фрагментов? И то и другое важно. Более того, измерив массу целой молекулы, исследователи часто специально дробят ее на куски. Так, определив массу структурных элементов белка, мы вместе с тем определяем и их количество, что позволяет нам делать выводы о его химическом составе и структуре.

Все это говорит о разнообразии существующих масс-спектрометров, каждый из которых применяется для решения задач в конкретной области. Этот метод практически незаменим в тех случаях, когда ученым необходимо определить химический состав вещества. Фармацевты применяют масс-спектрометрические эксперименты при разработке лекарств, исследованиях фармакокинетики (то есть биохимических процессов, происходящих в организме при принятии лекарства) и метаболизма. Ученые-биологи используют масс-спектрометрию для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот. Кроме того, если мы хотим проверить качество воды или продуктов питания, то нам снова не обойтись без этого метода.

Отдельная инновационная область применения масс-спектрометрии - медицинская диагностика. К развитию множества заболеваний приводят структурные изменения белков нашего организма: обычно они классифицируются по образованию характерного кусочка, пептида-маркера. Если вовремя определить такую мутацию, то появляется возможность лечить болезнь на ранней стадии. Кроме того, благодаря современным масс-спектрометрам становится возможным проводить исследования такого рода в режиме реального времени - например, в ходе нейрохирургической операции. Это позволяет точно определять границы между здоровой тканью и опухолью, что критически важно для хирургов.

Кажущаяся на первый взгляд сухой и узкопрофильной, масс-спектрометрия при внимательном ознакомлении оказывается удивительно богатой областью, объединяющей широкий класс приложений с необычными инженерными решениями. Наука показывает, что ответы на менее фундаментальные вопросы порой не менее интересны.

Данный метод принципиально отличается от рассмотренных выше спектроскопических методов. Структурная масс-спектрометрия основана на разрушении органической молекулы в результате ионизации тем или иным способом.

Образующиеся ионы сортируются по величинам их отношения масса/заряд (m/z), затем регистрируется число ионов для каждого значения этого отношения в виде спектра. На рис. 5.1. представлена общая схема типичного масс-спектрометра.

Рис. 5.1. Блок-схема типичного масс-спектрометра

Для ведения пробы в масс-спектрометр обычно применяют какой-либо вид хроматографии, хотя во многих приборах есть возможность для прямого ввода образца в ионизационную камеру. Во всех масс-спектрометрах имеются устройства для ионизации пробы и разделения ионов по величине m/z. После разделения нужно детектировать ионы и измерять их количество. Типичный коллектор ионов состоит из коллимирующих щелей, которые направляют в коллектор в данный момент только ионы одного вида, где они детектируются, а сигнал детектирования усиливается электронным умножителем. Современные масс-спектрометры укомплектованы специализированным программным обеспечением: компьютеры контролируют накопление, хранение и визуализацию данных.

В настоящее время стала обычной практика объединения масс-спектрометра с газовым (ГХ-МС) или жидкостным (ЖХ-МС) хроматографом.

Все масс-спектрометры подразделяются на два класса: приборы низкого (единичного) и высокого разрешения (R). Спектрометры низкого разрешения – приборы, на которых можно разделить целые массы до m/z 3000 (R = 3000/(3000-2990) = 3000). На таком приборе соединения C 16 H 26 O 2 и С 15 Н 24 NO 2 неразличимы, поскольку прибор будет фиксировать и в первом и во втором случае массу 250.

Приборы высокого разрешения (R = 20000) смогут различить соединения C 16 H 26 O 2 (250.1933) и С 15 Н 24 NO 2 (250.1807), в этом случае R = 250.1933/(250.1933 – 250.1807) = 19857.

Таким образом, на приборах низкого разрешения можно устанавливать структурную формулу вещества, однако зачастую для этой цели дополнительно необходимо привлекать данные других методов анализа (ИК-, ЯМР-спектроскопия).

Приборы высокого разрешения могут измерять массу иона с точностью, достаточной для определения атомного состава, т.е. определять молекулярную формулу исследуемого вещества.

В последнее десятилетие происходило быстрое развитие и совершенствование масс-спектрометров. Не обсуждая их устройство, отметим, что они подразделяются по типам в зависимости от 1) способа ионизации, 2) метода разделения ионов. В общем, способ ионизации не зависит от метода разделения ионов и наоборот, хотя имеются исключения. Более полная информация по данным вопросам изложена в литературе [Сайнсб. Лебедев].

В данном пособии будут рассмотрены масс-спектры, полученные ионизацией электронным ударом.

5.2. Масс-спектры с ионизацией электронным ударом

Электронный удар (ЭУ, electron impact, EI) – наиболее распространенный метод ионизации в масс-спектрометрии. Преимуществом этого метода является возможность использования поисковых систем и баз данных (метод ЭУ был исторически первым методом ионизации, основные базы экспериментальных данных получены на приборах с ЭУ).

Молекула вещества пробы в газовой фазе подвергается бомбардировке электронов с высокой энергией (обычно 70 эВ) и выбрасывает электрон, образуя катион-радикал, называемый молекулярным ионом :

М + e → М + (молекулярный ион) + 2e

Наименьшая энергия бомбардирующих (ионизующих) электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией (или, менее удачно, «потенциалом») ионизации вещества (U e).

Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее сильно связанный с ней электрон.

Как правило, для органических молекул энергия ионизации составляет 9-12 эВ, поэтому бомбардировка электронами с энергией 50 эВ и выше сообщает избыточную внутреннюю энергию возникающему молекулярному иону. Эта энергия частично рассеивается за счет разрыва ковалентных связей.

В результате такого разрыва происходит распад молекулярного иона на частицы меньшей массы (фрагменты). Такой процесс называется фрагментацией .

Фрагментация происходит избирательно, является высоковоспроизводимой и характеристичной для данного соединения . Более того, процессы фрагментации предсказуемы, и именно они обуславливают широкие возможности масс-спектрометрии для структурного анализа. По-сути, структурный анализ методом масс-спектрометрии заключается в идентификации осколочных ионов и ретроспективном восстановлении структуры исходной молекулы, исходя из направлений фрагментации молекулярного иона. Так, например, метанол образует молекулярный ион по схеме:

О
дна точка – оставшийся нечетный электрон; когда заряд локализован на отдельном атоме, знак заряда указывается на этом атоме.

Многие из этих молекулярных ионов распадаются за время 10 -10 – 10 -3 с и дают ряд осколочных ионов (первичная фрагментация):

Если некоторые из молекулярных ионов имеют достаточно большое время жизни, то они достигают детектора и регистрируются в виде пика молекулярного иона. Поскольку заряд исходного иона равен единице, отношение m / z для этого пика дает молекулярную массу исследуемого вещества.

Таким образом, масс-спектр – это представление относительных концентраций положительно заряженных осколков (включая молекулярный ион) в зависимости от их масс .

В специальной литературе приводятся таблицы наиболее часто встречающихся фрагментных ионов, где указана структурная формула иона и его значение m/z [Преч, Гордон, Сильверстейн].

Высота наиболее интенсивного в спектре пика принимается за 100%, а интенсивности других пиков, включая пик молекулярного иона, выражаются в процентах от максимального пика.

В определенных случаях самым интенсивным может быть и пик молекулярного иона. В общем случае: интенсивность пика зависит от устойчивости образующегося иона .

В масс-спектрах часто присутствует серия пиков фрагментных ионов, различающихся на гомологическую разность (СН 2), т.е. 14 а.е.м. Гомологические серии ионов характерны для каждого класса органических веществ, а потому они несут важную информацию о структуре исследуемого вещества.

Применение масс-спектрометрии

• · Ядерная энергетика;
• · Археология;
• · Нефтехимия;
• · Геохимия (изотопная геохронология);
• · Агрохимия;
• · Химическая промышленность;
• · Анализ полупроводниковых материалов, особо чистых металлов, тонких пленок и порошков (например, оксидов U и РЗЭ);
• · Фармацевтика - для контроля качества производимых лекарств и выявления фальсификатов;
• · Медицинская диагностика;
• · Биохимия - идентификация белков, исследование метаболизма лекарственных средств.

Хромато-масс-спектрометрия

Хромато-масс-спектрометрия - метод анализа смесей главным образом органических веществ и определения следовых количеств веществв объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго - идентификацию и определение строения вещества, количественный анализ. Известны 2 варианта хромато-масс-спектрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Рис. 10.

Первые исследования аналитических возможностей хромато-масс-спектрометрии были проведены в 1950-х гг., первые промышленные приборы, объединяющие газо-жидкостной хроматограф и

масс-спектрометр, появились в 60-х гг. Принципиальная совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10 -5 - 10 -6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10 5 Па. Для понижения давления используют сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим - с ионным источником масс-спектрометра. Сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Принцип действия сепараторов основан либо на различии подвижности молекул газа-носителя и анализируемого вещества, либо на их различной проницаемости через полупроницаемую мембрану. В промышленности чаще всего применяют инжекторные сепараторы, работающие по первому принципу. Одностадийные сепараторы этого типа содержат две форсунки с отверстиями небольшого диаметра, которые установлены точно напротив друг друга. В объеме между форсунками создается давление 1,33 Па. Газовый поток из хроматографической колонки через первую форсунку со сверхзвуковой скоростью попадает в область вакуума, где молекулы распространяются со скоростями, обратно пропорциональными их массе. В результате более легкие и быстрые молекулы газа-носителя откачиваются насосом, а более медленные молекулы органического веществава попадают в отверстие второй форсунки, а затем в ионный источник масс-спектрометра. Некоторые приборы снабжены двухстадийным сепаратором, снабженным еще одним подобным блоком форсунок. В объеме между ними создается высокий вакуум. Чем легче молекулы газа-носителя, тем эффективнее они удаляются из газового потока и тем выше обогащение органическим веществом.

Наиболее удобный для хромато-масс-спектрометрии газ-носитель - гелий. Эффективность работы сепаратора, т.е. отношение количества органического вещества в газовом потоке, выходящем из колонки, к его количеству, поступающему в масс-спектрометр, в значительной степени зависит от расхода газа-носителя, попадающего в сепаратор. При оптимальном расходе 20-30 мл/мин удаляется до 93% газа-носителя, а в масс-спектрометр поступает более 60% анализируемого вещества. Такой расход газа-носителя типичен для насадочных колонок. В случае использования капиллярной хроматографической колонки расход газа-носителя не превышает 2-3 мл/мин, поэтому на ее выходе в газовый поток добавляют дополнительное количество газа-носителя, чтобы скорость потока, поступающего в сепаратор, достигла 20-30 мл/мин. Тем самым обеспечивается наилучшая эффективность сепаратора. Гибкие кварцевые капиллярные колонки могут вводиться непосредственно в ионный источник. В этом случае ионный источник должен быть обеспечен мощной откачивающей системой, поддерживающей высокий вакуум.

В масс-спектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества.

Важное условие работы прибора - быстрая запись масс-спектра, который должен регистрироваться за время, гораздо меньшее, чем время выхода хроматографического пика. Медленная запись масс-спектра может исказить соотношение интенсивностей пиков в нем. Скорость регистрации масс-спектра (скорость сканирования) определяется масс-анализатором. Наименьшее время сканирования полного масс-спектра (несколько миллисекунд) обеспечивает квадрупольный анализатор. В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс - время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы.

Как описано выше, могут быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках хромато-масс-спектрометрии. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочей температуры колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя. Если вещества не удовлетворяют этим требованиям, их можно химически модифицировать, например силилированием, алкилированием или ацилированием гидрокси-, карбокси-, меркапто-, аминогрупп.

Чувствительность хромато-масс-спектрометрии (обычно 10 -6 -10 -9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10 -12 -10 -15 г) разновидность хромато-масс-спектрометрии - масс-фрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хромато-масс-спектрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия). Осуществляют масс-фрагментографию на хромато-масс-спектрометрах с использованием специального устройства - многоионного детектора либо с помощью ЭВМ, которая может строить хроматограммы по одному или нескольким ионам. Такая хроматограмма, в отличие от обычной, содержит пики лишь тех компонентов, в масс-спектрах которых есть такие ионы. Анализ проводят с применением внутреннего стандарта, в качестве которого часто используют аналог искомого вещества, меченный стабильными изотопами (2 Н, 13 С, 15 N, 18 O).

Другой вариант хромато-масс-спектрометрии заключается в сочетании высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖ хромато-масс-спектрометрии. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0,5-5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

В ряде промышленных приборов реализован принцип ленточного транспортера. Элюат из колонки попадает на движущуюся ленту, которая проходит через обогреваемую ИК излучением камеру, где испаряется растворитель. Затем лента с веществом проходит через область, обогреваемую другим нагревателем, где испаряется анализируемое вещество, после чего оно поступает в ионный источник и ионизируется. Более эффективный способ сочетания высокоэффективного газо-жидкостного хроматографа и масс-спектрометра основан на электро- и термораспылении. В этом случае элюат пропускают через капилляр, нагретый до 150 °С, и распыляют в вакуумную камеру. Ионы буфера, присутствующие в растворе, участвуют в ионообразовании. Образовавшиеся капли несут положительный, или отрицательный заряд. Вдоль капли из-за малого ее диаметра создается высокий градиент электрического поля, причем по мере распада капель этот градиент возрастает. При этом происходит десорбция из капель протонированных ионов или кластеров (молекула вещества + катион буфера).

Метод хромато-масс-спектрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и др.