Бордетеллы коклюша и коклюш, паракоклюш. Коклюш: микробиология, эпидемиология и патогенез Основной метод исследования
Учебник состоит из семи частей. Часть первая – «Общая микробиология» – содержит сведения о морфологии и физиологии бактерий. Часть вторая посвящена генетике бактерий. В части третьей – «Микрофлора биосферы» – рассматривается микрофлора окружающей среды, ее роль в круговороте веществ в природе, а также микрофлора человека и ее значение. Часть четвертая – «Учение об инфекции» – посвящена патогенным свойствам микроорганизмов, их роли в инфекционном процессе, а также содержит сведения об антибиотиках и механизмах их действия. Часть пятая – «Учение об иммунитете» – содержит современные представления об иммунитете. В шестой части – «Вирусы и вызываемые ими заболевания» – представлены сведения об основных биологических свойствах вирусов и о тех заболеваниях, которые они вызывают. Часть седьмая – «Частная медицинская микробиология» – содержит сведения о морфологии, физиологии, патогенных свойствах возбудителей многих инфекционных заболеваний, а также о современных методах их диагностики, специфической профилактики и терапии.
Учебник предназначен для студентов, аспирантов и преподавателей высших медицинских учебных заведений, университетов, микробиологов всех специальностей и практических врачей.
5-е издание, исправленное и дополненное
Книга:
Коклюш – острое инфекционное заболевание преимущественно детского возраста, характеризующееся циклическим течением и приступообразным спазматическим кашлем.
Возбудитель – Bordetella pertussis – впервые был обнаружен в 1900 г. в мазках из мокроты ребенка и затем выделен в чистой культуре в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу. Возбудитель сходного с коклюшем, но протекающего более легко заболевания – Bordetella parapertussis – был выделен и изучен в 1937 г. Г. Эльдерингом и П. Кендриком и независимо от них в 1937 г. У. Брэдфордом и Б. Славиным. Bordetella bronchiseptica , возбудитель редко встречающегося у человека коклюшеподобного заболевания, был выделен в 1911 г. у собак Н. Ферри, а у человека – в 1926 г. Брауном. В 1984 г. был выделен новый вид – Bordetella avium , патогенность которого для человека пока не установлена.
Бордетеллы относятся к классу Betaproteobacteria , грамотрицательны, хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями. Иногда выявляется биполярная окраска за счет зерен волютина на полюсах клетки. Возбудитель коклюша имеет форму овоидной палочки (коккобактерии) размером 0,2 – 0,5 ? 1,0 – 1,2 мкм. Паракоклюш-
ная палочка имеет такую же форму, но несколько крупнее (0,6 ? 2 мкм). Расположены чаще поодиночке, но могут располагаться попарно. Спор не образуют, у молодых культур и у бактерий, выделенных из макроорганизма, обнаруживается капсула. Бордетеллы неподвижны, за исключением B. bronchiseptica , которая является перитрихом. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 61 – 70 мол %. Относятся к гемофильным бактериям. Бордетеллы – строгие аэробы, хемоорганотрофы. Оптимальная температура роста – 35 – 36 °C. Возбудитель коклюша в гладкой S-форме (так называемая фаза I), в отличие от двух других видов бордетелл, не растет на МПБ и МПА, так как его размножению мешают накопление в среде ненасыщенных жирных кислот, образующихся в процессе роста, а также возникающая при росте коллоидная сера и другие продукты метаболизма. Для их нейтрализации (или адсорбции) в среду выращивания коклюшных бактерий необходимо добавлять крахмал, альбумин и древесный уголь или ионообменные смолы. Микроб требует наличия в среде выращивания 3 аминокислот – пролина, цистеина и глутаминовой кислоты, источником которых служат гидролизаты казеина или фасоли. Традиционная среда для выращивания коклюшной палочки – среда Борде – Жангу (картофельно-глицериновый агар с добавлением крови), на ней она растет в виде гладких, блестящих, прозрачных куполообразных с жемчужным или металлическим ртутным оттенком колоний диаметром около 1 мм, которые вырастают на 3 – 4-й день. На другой среде – казеиново-угольном агаре (КУА) – также на 3 – 4-й день вырастают гладкие выпуклые колонии диаметром около 1 мм, имеющие серовато-кремовый цвет и вязкую консистенцию. Колонии паракоклюшных бактерий по внешнему виду не отличаются от коклюшных, но крупнее и выявляются на 2 – 3-й день, а колонии B. bronchiseptica выявляются уже на 1 – 2-й день.
Характерной особенностью коклюшных бактерий является их наклонность к быстрому изменению культуральных и серологических свойств при изменении состава питательной среды, температуры и других условий выращивания. В процессе перехода от S-формы (фаза I) к стабильной шероховатой R-форме (фаза IV) через промежуточные фазы II и III наблюдаются плавные изменения антигенных свойств;
патогенные свойства теряются.
Паракоклюшные бактерии и B. bronchiseptica , а также фазы II, III и IV коклюшных бактерий растут на МПА и МПБ. При выращивании на жидкой среде наблюдается диффузное помутнение с придонным плотным осадком; клетки могут быть несколько крупнее и полиморфными, иногда образуют нити. В R-форме и промежуточных формах бактерии проявляют выраженный полиморфизм.
На среде Борде – Жангу все бордетеллы образуют вокруг колоний нерезко ограниченную зону гемолиза, распространяющуюся диффузно в среду.
Бордетеллы не ферментируют углеводов, не образуют индола, не восстанавливают нитраты в нитриты (за исключением B. bronchiseptica ). Паракоклюшные бактерии выделяют тирозиназу, образуя пигмент, окрашивающий среду и культуру в коричневый цвет. Дифференциальные признаки бордетелл приведены в табл. 46.
Бордетеллы содержат несколько антигенных комплексов. Соматический О-антиген видоспецифичен (см. табл. 43); родовым антигеном является агглютиноген 7. Главные агглютиногены у возбудителя коклюша – 7-й (родовой), 1-й (видовой) и наиболее часто обнаруживаемые типоспецифические 2-й и 3-й. В зависимости от их сочетания у Bordetella pertussis выделяют четыре сероварианта: 1, 2, 3; 1, 2, 0; 1, 0, 3 и 1, 0, 0.
Факторы патогенности. Фимбрии (агглютиногены), белок наружной мембраны пертактин (69 кД) и филаментозный гемагглютинин (поверхностный белок) отвечают за адгезию возбудителя на цилиарном эпителии средних отделов респираторного тракта (трахея, бронхи). Капсула защищает от фагоцитоза. Часто присутствуют гиалуронидаза, лецитиназа, плазмокоагулаза, аденилатциклаза. В составе эндотоксина
Таблица 46
Дифференциальные признаки бордетелл
Примечание. (+) – признак положительный; (–) – признак отрицательный; (±) – признак иногда положительный, иногда отрицательный; (?) – нет данных.
(ЛПС) два липида: А и Х. Биологическая активность ЛПС определяется липидом Х, липид А обладает низкой пирогенностью и нетоксичен. ЛПС обладает иммуногенностью (цельноклеточная вакцина), но вызывает сенсибилизацию. Имеются три экзотоксина. Коклюшный токсин (117 кД) по структуре и функции подобен холерогену, проявляет активность АДФ-рибозилтрансферазы (рибозилирует трансдуцин – белок мембраны клетки-мишени, являющийся частью системы, ингибирующей клеточную аденилатциклазу), сильный иммуноген, повышает лимфоцитоз и выработку инсулина. Трахеальный цитотоксин представляет собой фрагмент пептидогликана, обладает пирогенностью, артритогенностью, индуцирует медленноволновой сон и стимулирует продукцию IL-1, в ответ на который синтезируется оксид азота (цитотоксический фактор). Повреждает эпителиальные клетки трахеи и вызывает цилиостаз. Термолабильный дермонекротоксин обладает нейротропностью, сосудосуживающей активностью, гомологичен цитотоксическому некротизирующему фактору 1 (CNF1) кишечной палочки. Мишенью его являются Rho-белки мембран клеток. Обнаруживают дермонекротоксин внутрикожной пробой на кроликах (проба Дольда).
Эпидемиология. Источник инфекции при коклюше и паракоклюше – больной типичной или стертой формой, особенно в период до появления спазматического кашля. При коклюшеподобном заболевании, вызванном B. bronchiseptica , источником инфекции могут быть домашние и дикие животные, среди которых иногда наблюдаются эпизоотии (свиньи, кролики, собаки, кошки, крысы, морские свинки, обезьяны), при этом чаще всего у животного поражается респираторный тракт. Механизм заражения – воздушно-капельный. Бордетеллы обладают специфическим тропизмом к цилиарному эпителию респираторного тракта хозяина. К инфекции восприимчивы люди всех возрастов, но более всего дети от 1 года до 10 лет.
Патогенез и клиника. Инкубационный период при коклюше от 3 до 14 дней, чаще 5 – 8 дней. Возбудитель, попавший на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, размножается в клетках цилиарного эпителия и далее бронхогенным путем распространяется в более низкие отделы (бронхиолы, альвеолы, мелкие бронхи). При действии экзотоксина эпителий слизистой оболочки некротизируется, в результате чего раздражаются кашлевые рецепторы и создается постоянный поток сигналов в кашлевой центр продолговатого мозга, в котором формируется стойкий очаг возбуждения. Это приводит к возникновению спазматических приступов кашля. Бактериемии при коклюше не бывает. Вторичная бактериальная флора может приводить к осложнениям.
В течении заболевания выделяют следующие стадии: 1) катаральный период, длящийся около 2 нед. и сопровождающийся сухим кашлем; состояние больного постепенно ухудшается; 2) конвульсивный (судорожный), или спазматический, период, длящийся до 4 – 6 нед. и характеризующийся возникающими до 20 – 30 раз в сутки приступами неукротимого «лающего» кашля, причем приступы могут быть спровоцированы даже неспецифическими раздражителями (свет, звук, запах, медицинские манипуляции, осмотр и т. д.); 3) период разрешения, когда приступы кашля становятся реже и все менее продолжительными, отторгаются некротизированные участки слизистой оболочки верхних дыхательных путей, часто в виде «слепков» с трахеи и бронхов; продолжительность – 2 – 4 нед.
Иммунитет. После перенесенного заболевания формируется стойкий пожизненный иммунитет; поствакцинальный иммунитет сохраняется всего 3 – 5 лет.
Лабораторная диагностика. Основными методами диагностики являются бактериологический и серологический; для ускоренной диагностики, особенно на ранней стадии болезни, может быть использована реакция иммунофлуоресценции. Для выделения чистой культуры в качестве материала используют слизь из носоглотки или мокроту, которые высевают на КУА или среду Борде – Жангу. Посев также может быть сделан методом «кашлевых пластинок». Выросшую культуру идентифицируют по совокупности культуральных, биохимических и антигенных свойств. Серологические реакции – агглютинации, связывания комплемента, пассивной гемагглютинации – ставятся в основном для ретроспективной диагностики коклюша или в тех случаях, когда не выделена чистая культура. Антитела к возбудителю появляются не ранее 3-й нед. заболевания, диагноз подтверждается возрастанием титра антител в сыворотках, взятых с 1 – 2-недельным интервалом. У детей первых двух лет жизни серологические реакции часто бывают отрицательными.
Специфическая профилактика и лечение. Для плановой профилактики коклюша у детей используют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС), содержащую 20 млрд убитых коклюшных бактерий в 1 мл. На этом же компоненте основана выпускаемая отдельно убитая коклюшная вакцина, применяемая в детских коллективах по эпидемиологическим показаниям. Этот компонент реактогенен (нейротоксическое свойство), поэтому сейчас активно изучаются бесклеточные вакцины, содержащие от 2 до 5 компонентов (коклюшный анатоксин, филаментозный гемагглютинин, пертактин и 2 агглютиногена фимбрий). Для лечения применяют антибиотики (гентамицин, ампициллин), эффективные в катаральном и бесполезные в судорожном периоде заболевания.
№ 20 Возбудители коклюша и паракоклюша. Таксономия и характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.
Коклюш
- острая инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением верхних дыхательных путей, приступами спазматического кашля; наблюдается преимущественно у детей. Возбудитель коклюша Bordetellapertussis
Таксономия.
B.pertussis относится к отделу Gracilicutes, роду Bordetella.
Морфологические и тинкториальные свойства.
В.pertussis - мелкая овоидная грамотрицательная палочка с закругленными концами. Спор и жгутиков не имеет, образует микрокапсулу, пили.
Культуральные и биохимические свойства
. Строгий аэроб. Оптимальная температура культивирования 37С. B.pertussis очень медленно растет только на специальных питательных средах, например на среде Борде - Жангу (картофельно-глицериновый агар с добавлением крови), образуя колонии, похожие на капельки ртути.Характерна R-S-трансформация. Расщепляют глк. и лактозу до кислоты без газа.
Антигенная структура.
О-антиген термостабильный родоспецифический. 14 поверхностных термолабильных капсульных К-антигенов. В.pertussis имеет 6 сероваров. Фактор 7 является общим для всех бордетелл. Для В.parapertussis специфический фактор 14. К – антигены выявляют в реакции агглютинации.
Факторы патогенности.
Термостабильный эндотоксин, вызывающий лихорадку; белковый токсин, обладающий антифагоцитарной активностью и стимулирующий лимфоцитоз; ферменты агрессии, повышающие сосудистую проницаемость, обладающие гистаминсенсибилизирующим действием, адгезивными свойствами и вызывающие гибель эпителиальных клеток. В адгезии бактерий также участвуют гемагглютинин, пили и белки наружной мембраны.
Резистентность.
Очень неустойчив во внешней среде, быстро разрушается под действием дезинфектантов и других факторов.
Эпидемиология.
Коклюш - антропонозная инфекция: источником заболевания являются больные люди и в очень незначительной степени бактерионосители. Заражение происходит через дыхательный тракт, путь передачи воздушно-капельный. Коклюш встречается повсеместно, очень контагиозен. Паракоклюш реже, эпизодический характер. Протекает легче.
Патогенез.
Неинвазивные микробы (не проникают внутрь клетки-мишени). Входными воротами инфекции являются верхние дыхательные пути. Здесь благодаря адгезивным факторам бордетеллы адсорбируются на ресничках эпителия, размножаются, выделяют токсины и ферменты агрессии. Развиваются воспаление, отек слизистой оболочки, при этом часть эпителиальных клеток погибает. В результате постоянного раздражения токсинами рецепторов дыхательных путей появляется кашель. В возникновении приступов кашля имеет значение и сенсибилизация организма к токсинам B.pertussis.
Клиника.
Инкубационный период составляет 2-14 дней. В начале болезни появляются недомогание, невысокая температура тела, небольшой кашель, насморк. Позже начинаются приступы спазматического кашля, заканчивающиеся выделением мокроты. Таких приступов может быть 5-50 в сутки. Болезнь продолжается до 2 мес.
Иммунитет.
После перенесенной болезни иммунитет стойкий, сохраняется на протяжении всей жизни. Видоспецифический (антитела против В.pertussis не защищают от заболеваний, вызванных В.parapertussis.
Микробиологическая диагностика.
Материалом для исследования служит слизь из верхних дыхательных путей, используют метод «кашлевых пластинок» (во время приступа кашля ко рту ребенка подставляют чашку Петри с питательной средой). Основной метод диагностики - бактериологический. Позволяет отдифференцировать возбудителя коклюша от паракоклюша. Посев на плотные питательные среды с антибиотиками. Для идентификации возбудителя – реакция агглютинации на стекле с К-сыворотками. Для ускоренной диагностики применяют прямую РИФ со специфической флуоресцентной сывороткой и материалом из зева. Серологический метод – обнаружение IgG и IgA против феламентозного гемаггютинина и против токсина В.pertussis.
Лечение.
Антимикробные препараты – эритромицин, ампициллин (кроме пенициллина). При тяжелых формах коклюша применяют нормальный человеческий иммуноглобулин. Рекомендуются антигистаминные препараты, холодный свежий воздух. При легких формах заболевания достаточно пребывания на воздухе.
Профилактика.
Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС). В ее состав входит убитая культура В. pertussisI фазы, коклюшный токсин, агглютиногены, капсульный антиген. Нормальный человеческий иммуноглобулин вводят неиммунизированным детям при контакте с больными для экстренной профилактики. Разрабатывается неклеточная вакцина с меньшими побочными эффектами, содержащая анатоксин, гемагглютинин, пертактин и антиген микроворсинок.
Паракоклюш
вызывает Bordetellaparapertussis. Паракоклюш сходен с коклюшем, но протекает легче. Паракоклюш распространен повсеместно и составляет примерно 15 % от числа заболеваний с диагнозом коклюш. Перекрестный иммунитет при этих болезнях не возникает. Возбудитель паракоклюша можно отличить от B.pertussis по культуральным, биохимическим и антигенным свойствам. Иммунопрофилактика паракоклюша не разработана.
К числу острых инфекционных недугов детского возраста относится коклюш. Заболевание носит воспалительный характер, в который вовлекаются слизистые оболочки гортани, трахеи, бронхов и бронхиол. Отличительным фактором является спастический, приступообразный кашель и цикличность процесса.
Исторические сведения о заболевании идут еще со времен средневековых эпидемий в странах Европы. Возбудителем является Bordetella pertussis, которая была подробно описана в 1906 году бельгийским и французским учеными Жюлем Борде и Октавом Жангу. Вакцинация же стала возможна только через полвека.
Морфологическим и генетическим сходством с Bordetella pertussis обладает Bordetella parapertussis. Палочка паракоклюша вызывает коклюшеподобное заболевание, но в значительно легкой форме.
Микробиология возбудителя
Ярким представителем возбудителей острых респираторных заболеваний является род Bordetella. Наиболее значимы среди них в эпидемиологическом плане бактерии коклюша и паракоклюша. Bordetella pertussis (возбудитель коклюша) – мелкая овальная палочка с закругленными краями, споры и жгутики у нее отсутствуют, неподвижна.
Все представители данного рода грамотрицательны, имеют вид палочек довольно малого размера.
Микробиология коклюша:
- Структурными особенностями бактерии являются микрокапсула, белковые пили (микроскопические ворсинки) и клеточная стенка с наружной и внутренней перегородкой.
- На начальном этапе развития палочка коклюша содержит факторы, которые определяют клинические проявления и патогенез заболевания: термолабильный токсин, гистамин-сенсебилизирующий фактор и др.
- Микроб очень неустойчив в окружающей среде, погибает при воздействии ультрафиолета и свежего воздуха в течение 60 мин, быстро нейтрализуется дезрастворами.
- Bordetella pertussis является облигатным аэробом (жизнеспособна только в присутствии кислорода), размножается при температуре 370С на строго определенных средах. Колонии на среде имеют вид блестящей капли ртути или жемчужины.
Палочка паракоклюша в размерах несколько превосходит исходную бактерию коклюша. Морфология коклюша и паракоклюша схожа, но имеются различия в особенностях роста и во внешнем виде колоний.
Диагностика
Заболевание отличается довольно длительным течением, что дает возможность в диагностике использовать такие методики, как: микроскопическая, серологическая, и прикладная микробиология. Коклюш определяется на любом этапе развития воспалительного процесса.
Микроскопия
Возбудитель имеет четкие морфологические особенности только на I этапе заболевания, поэтому микроскопия не является главным методом в диагностике коклюша. Но он незаменим при определении стадий патологического процесса, потому что вид микроорганизма разнится при переходе болезни из I стадии во II и III.
Бактериологический метод исследования
На сегодняшний день самым ранним и информативным методом диагностики является анализ свежевыделенной культуры бактерий. Уже на 3–4-й день он дает возможность отличить палочку коклюша от возбудителей септического бронхита и паракоклюша.
Материалом для микробиологического анализа служит мокрота и смывы из глотки человека. Для забора материала часто используется метод «кашлевых пластинок». Для этого чашку Петри вместе со средой подносят вертикально ко рту пациента при кашле (нужно уловить 4–5 кашлевых выдохов), после чего чашку закрывают и термостатируют.
Так как Bordetella pertussis очень прихотлива к трофическому субстрату и условиям роста, для выращивания культуры пользуются элективными средами:
- Молочно-кровяным агаром Осиповой.
- Средой Борде-Жангу (картофель-глицериновый агар с кровью кролика).
- Уголь-картофельным агаром.
Для исключения роста бактерий-загрязнителей на чашках в среду добавляется антибиотик.
Самой подходящей температурой культивирования является интервал 35–37 градусов, рН среды должен быть нейтральным (в районе 7,2).
Колонии палочек коклюша появляются на 3–4 день от посева, они мелкие, выпуклые, прозрачные, глянцеватые, похожи на капли ртути, с зоной гемолиза по периметру (если в среде есть кровь), около 1 мм в диаметре. Колонии микробов паракоклюша больше по размеру, чем исходные, появляются раньше и дают выраженное окрашивание среды в коричневый цвет на козеиновом агаре.
Скопления бактерий рассматривают при помощи лупы или микроскопа. Подозрительные колонии отбирают для окрашивания по Граму.
Серология
Серологические способы исследования подходят для ретроспективной диагностики, т. к. антитела в крови больного появляются только на 3–4 неделе болезни. Обнаружить данные антитела возможно в ходе реакции агглютинации и реакции связывания комплемента по Борде-Жангу.
iv>
ГБОУ ВПО “Уральский государственный медицинский университет” Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Методические указания к практическим занятиям для студентов
ООП специальности 060301.65 Фармация Дисциплина С2.Б.11 Микробиология
1. Тема: Возбудители коклюша и паракоклюша.
2. Цели занятия : Изучить со студентами свойства возбудителей коклюша и паракоклюша, факторы патогенности и патогенез вызываемых заболеваний, методы диагностики, профилактики и лечения коклюша и паракоклюша.
3. Задачи занятия:
3.1. Изучение свойств возбудителей коклюша и паракоклюша.
3.2. Изучение факторов патогенности возбудителя и патогенеза коклюша.
3.3. Изучение методов диагностики, профилактики и лечения коклюша и паракоклюша.
3.4. Выполнение самостоятельной работы.
компетенции |
||||
Способность и |
Морфологичес- |
Пользоваться |
Методикой |
|
готовность |
кие, культураль- |
инструментарием |
приготовления |
|
анализировать |
ные, биохимии- |
при проведении |
препарата для |
|
социально значимые |
ческие свойства |
микробиологических |
бактериоскопического |
|
проблемы и процессы, |
возбудителей |
исследований |
исследования. |
|
использовать на |
коклюша и |
Техникой посева |
||
практике методы |
паракоклюша |
материала на |
||
гуманитарных, |
питательные среды. |
|||
естественнонаучных, |
||||
медико-биологических |
||||
и клинических наук в |
||||
различных видах |
||||
профессиональной и |
||||
социальной |
||||
деятельности |
||||
Способность и |
Принципы и |
Проводить |
||
готовность к участию |
санитарно- |
биологическим |
||
в постановке научных |
диагностики, |
просветительную |
понятийным |
|
задач и их |
профилактики и |
работу с населением |
аппаратом |
|
экспериментальной |
||||
реализации |
4. Продолжительность занятия в академических часах : 3 часа.
5. Контрольные вопросы по теме:
5.1. Морфологические, тинкториальные, культуральные и биохимические свойства возбудителей коклюша, паракоклюша.
5.2. Факторы патогенности возбудителей коклюша, паракоклюша и патогенез вызываемых заболеваний.
5.3. Методы диагностики, профилактики и лечения коклюша и паракоклюша.
6. Задания и методические указания к их выполнению.
На занятии студенту необходимо:
6.1. Ответить на вопросы преподавателя.
6.2. Принять участие в обсуждении изучаемых вопросов.
6.3. Выполнить самостоятельную работу.
Теоретическая справка Коклюш - острое инфекционное заболевание дыхательных путей, основным
симптомокомплексом которого являются приступы судорожного кашля. Паракоклюш – это острое инфекционное заболевание дыхательных путей, клинически проявляющееся в виде легкой формы коклюша.
Возбудитель – Bordetella pertussis - впервые был обнаружен в 1900 г. в мазках из мокроты ребенка и затем выделен в чистой культуре в 1906 г. Ж. Борде и О. Жангу. Впоследствии возбудитель получил название палочка Борде-Жангу.
Возбудитель паракоклюша – Bordetella parapertussis .
Возбудители коклюша и паракоклюша относятся к отделу Gracilicutes ,
порядку Burkholderiales, семейству Alcaligenaceae, роду Bordetella, видам Bordetella pertussis (палочка Борде-Жангу, возбудитель коклюша) и Bordetella parapertussis (возбудитель паракоклюша).
Морфологические и тинкториальные свойства. Бордетеллы грамотрицательные. Возбудитель коклюша имеет форму овоидной палочки (коккобактерии). Паракоклюшная палочка более крупная. Бордетеллы располагаются чаще поодиночке. Спор не образуют, образуют капсулу. Неподвижные.
Культуральные свойства . Бордетеллы – облигатные аэробы. Оптимальная температура роста - 35-36°С. Требовательны к питательным средам. Для выращивания коклюшной палочки используется среда Борде-Жангу (картофельноглицериновый агар с добавлением крови и пенициллина), на ней она растет в виде гладких, блестящих, прозрачных куполообразных с жемчужным или металлическим ртутным оттенком колоний. На казеиново-угольном агаре (КУА) вырастают гладкие выпуклые колонии, имеющие серовато-кремовый цвет и вязкую консистенцию. Колонии паракоклюшных бактерий по внешнему виду не отличаются от коклюшных, но крупнее.
Биохимические свойства . Бордетеллы не ферментируют углеводов, не образуют индола, не восстанавливают нитраты в нитриты, вызывают гемолиз эритроцитов.
Антигенная структура . Выделяют соматический термостабильный О- антиген и поверхностные термолабильные капсульные К-антигены или агглютиногены (факторы 1-16).
Резистентность . Возбудитель коклюша вне организма быстро погибает (в течение нескольких часов). Высоко чувствителен к действию ультрафиолетовых лучей, дезинфицирующих веществ и температуре. При 50-55О С погибает через 30 минут, при кипячении - мгновенно. Чувствителен к полимиксину, стрептомицину, тетрациклину. Устойчив к пенициллину и сульфаниламидам.
1. Факторы адгезии:
Пили (фимбрии);
- филаментозный гемагглютинин;
- пертактин - белок наружной мембраны клеточной стенки;
- капсулъные агглютиногены.
Эти факторы способствуют адгезии бактерий к мерцательному эпителию верхних дыхательных путей (бронхов, трахеи).
2. Токсины бордетелл:
а) Пертуссис-токсин (коклюшный термолабильный экзотоксин). Он связывается с клетками, проникает в них, вызывает накопление цАМФ и гибель клетки.
б) Внеклеточная аденилатциклаза (аденилатциклазный гемолизин) нарушает “переваривающую” способность фагоцитов.
в) Трахеальный цитотоксин вызывает некроз и десквамацию мерцательного эпителия.
г) Дермонекротический токсин вызывает местную воспалительную реакцию эпителия респираторного тракта.
д) Термостабильный эндотоксин стимулирует выработку цитокинов, повреждающих эпителиальные клетки респираторного тракта.
3. Ферменты патогенности – гиалуронидаза, плазмокоагулаза. Эпидемиология . В естественных условиях к коклюшу восприимчив только
человек. Источник инфекции при коклюше и паракоклюше – больной человек
типичной или стертой формой, особенно в период до появления спазматического кашля. Путь передачи возбудителя - воздушно-капельный . Бордетеллы обладают специфическим тропизмом к реснитчатому эпителию респираторного тракта хозяина. К инфекции восприимчивы люди всех возрастов, но более всего дети от 1 года до 10 лет. Наиболее тяжело коклюш протекает у детей первого года жизни.
Патогенез . Входные ворота - слизистые оболочки гортани, трахеи, бронхов. Бордетеллы не проникают внутрь клетки (неинвазивные микробы) и не поступают в кровь.
Первая стадия – адгезия возбудителя на поверхности клеток.
Вторая стадия – местное повреждение тканей токсинами микроба. Возбудитель размножается на поверхности клеток эпителия, обусловливая развитие воспалительных катаральных явлений и возникновение очагов некроза. В более низкие отделы (мелкие бронхи, бронхиолы, альвеолы) возбудитель распространяется бронхогенным путем. Бактериемии при коклюше не бывает.
Третья стадия – стадия системных проявлений. Следствием некротических поражений является постоянное раздражение рецепторов афферентных волокон блуждающего нерва; возбуждение передается в область кашлевого центра, где формируется стационарный очаг возбуждения. В результате развивается основной симптомокомплекс коклюша – приступы судорожного кашля.
Клиника.
1. Инкубационный период продолжается от 5 до 21 дня (в среднем 7-10
2. Катаральный период характеризуется появлением незначительного кашля, насморка, субфебрильной температуры. Кашель не поддается медикаментозному лечению, постепенно усиливается и к концу второй недели приобретает приступообразный характер. В этот период возбудитель обильно выделяется из организма. Продолжительность катарального периода около двух недель.
3. Конвульсивный (судорожный, спазматический, пароксизмальный)
период . Появляется основной симптомокомплекс коклюша - приступы судорожного неукротимого “лающего” кашля, возникающие до 20-30 раз в сутки. Приступы могут развиваться под влиянием как специфических (микроб, его токсин), так и неспецифических (осмотр, звук, свет, инъекции и т.д.) раздражителей. Приступы заканчиваются отделением густой, вязкой мокроты. Кашель сопровождается цианозом лица и тела. При приступах кашля характерна поза больного – согнутая спина, высунутый язык. Может наступить асфиксия вследствие остановки дыхания; иногда наблюдается разрыв межреберных мышц. Температура тела в течение всего конвульсивного периода обычно остается нормальной. Продолжительность конвульсивного периода – 4-6 недель.
4. Период угасания (разрешения, выздоровления) – постепенно уменьшается число приступов, затем они исчезают; состояние нормализуется. Продолжительность периода угасания – 2-4 недели.
Иммунитет . После перенесенного заболевания формируется пожизненный гуморальный иммунитет.
Лабораторная диагностика . Основной метод - бактериологический. Для выделения чистой культуры в качестве материала используют слизь с задней стенки глотки, которую высевают на КУА или среду Борде-Жангу. Материал берут с помощью клювовидного (через рот) или прямого (через нос) тампона с задней стенки глотки. Посев также может быть сделан методом “кашлевых пластинок” (во время кашля ко рту больного на расстоянии 8-10 см подносят открытую чашку с питательной средой). Выросшую культуру идентифицируют по культуральным, биохимическим и антигенным свойствам.
В качестве ускоренного применяют иммунофлуоресцентный метод – РИФ
с материалом из зева больного и флюоресцентной сывороткой (позволяет получить ответ через 4-5 часов после взятия материала).
Серологические методы (реакция агглютинации, непрямой гемагглютинации, связывания комплемента) используют как вспомогательные при выявлении атипичных форм, а также для ретроспективной диагностики, поскольку антитела к возбудителю появляются не ранее третьей недели заболевания.
Специфическая профилактика . Для специфической профилактики коклюша используют адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину (АКДС), где коклюшный компонент представлен убитыми коклюшными бактериями.
Для лечения применяют антибиотики (гентамицин, ампициллин, эритромицин, тетрациклин), которые эффективны в катаральном периоде и не эффективны в судорожном периоде заболевания.
Возбудитель паракоклюша , Bordetella paraрertussis, близок к возбудителю коклюша по морфологическим и культуральным признакам. Паракоклюш проявляется клинически как легкая форма коклюша. Постановка диагноза возможна лишь при помощи микробиологических методов исследования. Взятие материала и лабораторная диагностика проводится так же, как при коклюше. Коклюш и паракоклюш – два самостоятельных заболевания. Дети, переболевшие коклюшем, могут заболеть паракоклюшем и наоборот.
После обсуждения теоретических вопросов преподаватель объясняет порядок проведения самостоятельной работы.
Самостоятельная работа:
Зарисовать в рабочей тетради схему лабораторной диагностики коклюша.
7. Оценивание знаний, умений, навыков по теме занятия:
Ответы на вопросы и активность на занятии оцениваются по 5-балльной системе.
8. Литература для подготовки темы:
8.1. Основная:
1. Галынкин В., Заикина Н., Кочеровец В. Основы фармацевтической микробиологии. 2008.
2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. Под ред. А.А. Воробьева. Учебники и учеб. пособия для высшей школы. Издательство: Медицинское информационное агентство, 2012. – 702 с.
3. Микробиология: учеб. для студентов учреждений высш. проф. образования, обучающихся по специальности 060301.65 “Фармация” / под ред. В.В. Зверева, М.Н. Бойченко. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 608 с.: ил.
4. Одегова Т.Ф., Олешко Г.И., Новикова В.В. Микробиология. Учебник для фармацевтических вузов и факультетов. - Пермь, 2009. - 378 с.
8.2. Дополнительная:
1. Коротяев А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: Учебник для студентов мед. вузов / А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. - 5-е изд., испр. и
доп. – СПб.: СпецЛит, 2012. – 759 с.: ил.
2. Медицинская микробиология: учебник. 4-е изд. Поздеев О.К. / Под ред. В.И. Покровского. – 2010. – 768 с.
3. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга 1 / Колл. авторов // Под редакцией Лабинской А.С., Волиной Е.Г. – М.: Издательство БИНОМ, 2008. – 1080 с.: ил.
Методические указания переработаны и дополнены профессором Литусовым Н.В.
Обсуждены на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии.
Возбудители этих заболеваний относятся к роду Bordetella.
1. Bordetella pertussis - возбудитель коклюша, описан Борде и Жангу в 1906 г.
2. Bordetella parapertussis - возбудитель паракоклюша, описан Элдеринг и Кондрик в 1937 г.
3. Bordetella bronchiseptica - вызывает заболевание у животных. У человека эти бактерии вызывают бронхопневмонию с коклюшеподобным кашлем. Впервые у человека это заболевание описано Брауном в 1926 г. (встречается редко).
Морфология . Бактерии коклюша - мелкие палочки овоидной формы, 0,3-0,5 × 1-1,5 мкм. Возбудитель пара-коклюша несколько большей величины. Оба микроба не имеют спор, неподвижны. При специальной окраске видна капсула. Грамотрицательны. Более интенсивно окрашиваются по полюсам.
На ультрасрезах видны капсулоподобная оболочка, зерна валютина, в нуклеиде - вакуоли.
Культивирование . Возбудители коклюша и паракоклюша - аэробы. Прихотливы к питательным средам. Для их выращивания применяют среду Борде - Жангу (глицериново-картофельный агар с кровью). В настоящее время пользуются средой КУА (казеиново-угольный агар) - это полусинтетическая среда без крови. Источником аминокислот здесь является гидролизат казеина. Среда КУА отличается от среды Борде - Жангу более простым и доступным методом изготовления.
Для угнетения роста посторонней флоры к среде добавляют пенициллин по 0,25 - 0,5 ME на 1 мл среды или метициллин - 2,5-4 мкг на 1 мл. Пенициллин можно наносить на поверхность среды в чашках.
Засеянные среды инкубируют в термостате при температуре 35-36° С, рН среды 6,8-7,4. Посевы необходимо предохранять от высыхания, для этого в термостат ставят сосуд с водой.
Колонии В. pertussis появляются через 48-72 ч, а В. parapertussis - через 24-48 ч.
На среде КУА колонии В. pertussis мелкие 1-2 мм в диаметре, В. parapertussis несколько крупнее. Колонии обоих микробов блестящие, серовато-кремового цвета (на казеиново-угольном агаре они напоминают капельки ртути). При снятии колоний остается вязкий, сметанообразный след. При изучении колоний в стереоскопическом микроскопе виден световой конус (колонии отбрасывают тень). Когда меняется положение светового источника (электролампочки) тень меняет положением Наличие светового конуса (хвостика) имеет диагностическое значение.
В. parapertussis образует фермент тирозиназу, поэтому в средах, содержащих тирозин, происходит его расщепление и среда окрашивается в коричневый цвет. Изменение цвета среды является дифференциально-диагностическим признаком.
В жидкой среде бактерии коклюша и паракоклюша образуют равномерную муть и придонный осадок. На агаре с кровью они дают зону гемолиза.
Свежевыделенные культуры чаще всего имеют гладкую S-форму (I фаза). При культивировании в неблагоприятных условиях или в материале, взятом в поздние сроки заболевания, могут появиться диссоциированные формы (II-IV фазы).
Ферментативные свойства . Возбудители коклюша не расщепляют углеводы и не ферментируют белки. Бактерии паракоклюша образуют ферменты уреазу и тирозиназу.
Бактерии коклюша и паракоклюша продуцируют ферменты патогенности: гиалуронидазу, плазмокоагулазу и лецитиназу.
Токсинообразование . В опытах на животных у коклюшной палочки были выявлены четыре типа токсина белковой природы: 1) термолабильный дермонекротический токсин; 2) термостабильный эндотоксин; 3) лейкоцитозостимулирующий фактор (стимулирующий лейкоцитоз); парентеральное введение его вызывало гибель экспериментальных животных; 4) гистаминсенсибилизирующий фактор - при введении его мышам у них повышалась чувствительность к гистамину.
Первые два типа токсина свойственны и возбудителю паракоклюша.
Антигенная структура . У бактерий рода Bordetella сложная антиренная структура. Наиболее важными антигенами для лабораторной диагностики являются агглютиногены. Родовым агглютиногеном является 7. Видоспецифическим агглютиногеном для бордетелл коклюша является 1, для бордетелл паракоклюша - 14, для бордетелл бронхосептика - 12.
Моноспецифические сыворотки 1, 14, 12 используются для дифференциации видов (сыворотки выпускает Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи).
Кроме видоспецифических антигенов, у представителей Bordetella имеются и другие агглютиногены, разное сочетание которых определяет серовар (табл. 48.).
По сочетанию трех главных агглютиногенов 1,2,3, определяемых в реакции агглютинации с моноспецифическими сыворотками, В. pertussis различают три серовара: 1,2,3; 1,2,0; 1,0,3.
Устойчивость к факторам окружающей среды . Возбудители коклюша и паракоклюша мало устойчивы. При температуре 56° С они погибают через 20-30 мин. Низкие температуры также губительно на них действуют. Прямой солнечный свет убивает их через 1-2 ч; УФ-лучи - через несколько минут. В сухой мокроте эти бактерии сохраняются в течение нескольких часов. Обычные растворы дезинфицирующих веществ губят их быстро.
Оба вида микробов мало чувствительны к антибиотикам, не чувствительны к пенициллину.
Восприимчивость животных . В естественных условиях животные не восприимчивы к возбудителям этого рода. В экспериментальных условиях удается воспроизвести коклюш у обезьян и молодых собак, вызвать гибель мышей.
Источники инфекции . Больной человек. Особенно заразны больные в катаральном периоде.
Пути передачи . Воздушно-капельный путь. Роль различных предметов мало вероятна ввиду неустойчивости коклюшных бактерий во внешней среде.
Патогенез . Возбудители коклюша и паракоклюша вызывают острое заболевание, сопровождающееся конвульсивным кашлем. Попав на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, бактерии размножаются там и частично разрушаются. Выделившийся токсин действует на центральную нервную систему, раздражает нервные рецепторы слизистой оболочки верхних дыхательных путей, что приводит в действие кашлевой рефлекс. В результате возникают приступы судорожного кашля. В процессе заболевания наблюдается несколько периодов: катаральный, спазматического кашля и разрешения процесса.
Иммунитет . После перенесенного заболевания вырабатывается стойкий иммунитет, который обусловливается гуморальными и клеточными факторами.
Профилактика . Выявление и изоляция больных. Ослабленным детям, находившимся в контакте с больным коклюшем, вводят иммуноглобулин. Основные меры специфической профилактики - иммунизация детей АКДС (коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной). Вакцину вводят троекратно в возрасте до 6 мес с последующей ревакцинацией.
Лечение . В ранних стадиях заболевания применяют противококлюшный иммуноглобулин. Для лечения используют эритромицин и ампициллин.
Контрольные вопросы
1. Опишите морфологические свойства возбудителя коклюша и паракоклюша.
2. На каких средах и каков характер роста коклюшных и паракоклюшных микробов?
3. Устойчивость возбудителей коклюша и паракоклюша во внешней среде.
4. Дифференциальные признаки возбудителей коклюша и паракоклюша.
5. Источники заражения, пути передачи, патогенез коклюша.
Микробиологическое исследование
Цель исследования: выявление возбудителя и дифференциация возбудителей коклюша от паракоклюша.
Материал для исследования
Отделяемое слизистой оболочки носоглотки.
Основной метод исследования
Микробиологический
Ход исследования
Второй - третий дни исследования
Посевы вынимают из термостата и просматривают, пользуясь лупой или стереоскопическим бинокулярным микроскопом. При наличии подозрительных колоний их выделяют на КУА: в чашках Петри, разделенных на сектора, или в пробирках. Посевы ставят в термостат. Если колоний много, из части их можно сделать мазки, покрасить и посмотреть под микроскопом. При наличии мелких грамотрицательных палочек ставят пробную реакцию агглютинации с моноспецифической родовой сывороткой 7. Положительная реакция агглютинации свидетельствует о принадлежности выделенной культуры к роду Bordetella. Для определения вида бордетелл ставят реакцию агглютинации с моноспецифическими видовыми сыворотками 1 и 14. Реакции ставят на предметном стекле. Положительный результат реакции агглютинации позволяет дать предварительный ответ.
Четвертый день исследования
Посевы вынимают из термостата и просматривают: сначала невооруженным глазом, обращая внимание на Цвет среды (нет ли коричневого окрашивания), затем изучают рост при помощи стереоскопического микроскопа.
При наличии подозрительных колоний из выделенной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и изучают под микроскопом. Затем повторно (из чистой культуры) ставят реакцию агглютинации на стекле с моноспецифическими сыворотками 1,2,3 и 14. Результаты агглютинации дают возможность отдифференцировать В. pertussis от В. parapertussis, и если это - В. pertussis, то определить серовар: 1-й серовар - (1,2,3), 2-й серовар - (1,2,0), 3-й серовар - (1,0,3). Определение серовара имеет эпидемиологическое значение.
Для окончательной идентификации выделенной культуры (при положительной агглютинации с моноспецифическими сыворотками) ставят пробу на наличие уреазы и производят посев на скошенный агар, содержащий 0,1% тирозина (см. рис. 49).
Проба на уреазу . В маленькую пробирку наливают 0,3-0,4 мл 2% раствора мочевины, вносят петлю культуры и добавляют 2-3 капли фенолфталеина. Пробирку встряхивают и ставят в термостат. Учитывают реакцию через 2 и 24 ч. Бактерии коклюша не изменяют цвет среды. Бактерии паракоклюша обладают ферментом уреазой, который расщепляют мочевину с образованием аммиака. Аммиак изменяет индикатор и среда окрашивается в красный цвет.
Проба с тирозином . На скошенный МПА в пробирках с 0,1% тирозином засевают выделенную культуру и ставят в термостат. На следующий день вынимают пробирку из термостата и просматривают ее. Наличие роста в пробирке и окрашивание среды в коричневый цвет свидетельствуют о росте возбудителей паракоклюша. Возбудители коклюша на этой среде не растут.
Пятый день исследования
При отсутствии подозрительных колоний дают отрицательный ответ.
Ускоренная диагностика
При бактериологическом методе исследования ответ можно получить через 3-4 дня.
1. Применение иммунно-люминесцентного метода позволяет дать ответ через несколько часов после взятия материала путем непосредственного выявления микробов в мазках, сделанных с тампонов.
2. Из посевов на среде КУА при отсутствии видимого роста можно сделать мазок-отпечаток: для этого стерильной резиновой пробкой дотрагиваются до места посева и переносят отпечаток на предметное стекло. Мазок-отпечаток изучают методом иммунофлюоресценции. В мазках обнаруживаются бактерии В. pertussis или В. parapertussis.
Контрольные вопросы
1. Что служит материалом для исследования при подозрении на коклюш?
2. Какие методы сбора материала применяют для выявления возбудителя при подозрении на коклюш?
3. Что прибавляют к среде для подавления роста посторонней микрофлоры?
1. Возьмите 10 чашек со средой КУА, флакон пенициллина, содержащий 300000 ЕД. Сделайте разведение пенициллина таким образом, чтобы в 0,1 мл содержалось 7,5 ЕД. Сделайте расчет на общее количество среды.
2. Соберите отделяемое носоглотки друг у друга и сделайте посев на среду КУА.
3. Возьмите у преподавателя чашку с культурой бактерий коклюша или паракоклюша, изучите характер колоний с помощью стереоскопического микроскопа. Подозрительные колонии посейте на сектор среды КУА (выделение чистой культуры).
4. Возьмите у преподавателя чистую культуру возбудителей коклюша или паракоклюша, выросшую на секторе среды КУА, и поставьте реакцию агглютинации с диагностической коклюшной сывороткой.
При наличии положительной реакции агглютинации поставьте пробу на уреазу и сделайте посев на среду с тирозином (0,1%).
Питательные среды
КУА. Среду готовит Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалея. Готовая среда КУА черного цвета, конденсационная вода не должна содержать частиц угля. В готовом виде среду можно сохранять продолжительное время (до месяца и более), предохраняя ее от высыхания.